测定血清50%溶血补体（CH50）活性

摘要

经典途径由抗体激活，最终导致靶细胞裂解。CH₅₀ 测定法用于评估血清样本的补体活性。本视频演示了测定血清样本 CH₅₀ 值的实验步骤、相关计算及结果解读。

摘要

补体系统是一组蛋白质，激活后可导致靶细胞裂解，并通过调理作用促进吞噬作用。虽然可以定量各个补体成分，但这并不能提供有关通路活性的任何信息。CH₅₀是用于检测经典补体途径激活的筛选实验（图1），该实验对途径中任何组分的减少、缺失和/或失活均具有敏感性。CH₅₀检测血清补体经典途径组分裂解预先包被兔抗羊红细胞抗体（溶血素）的羊红细胞（SRBC）的功能能力。当抗体包被的SRBC与待测血清孵育时，补体的经典途径被激活，从而导致溶血。如果某一补体组分缺失，则CH₅₀水平将为零；如果经典途径的一个或多个组分减少，则 CH₅₀将会降低。向每种血清稀释液中加入固定体积的最适致敏绵羊红细胞（SRBC）。孵育后，将混合物离心，并通过在540 nm处测定上清液中释放的血红蛋白吸光度来量化溶血程度。通过检测不同稀释度待测血清裂解抗体包被SRBC的能力，确定补体活性水平。本视频概述了分析经典补体途径补体活性水平所涉及的实验步骤。

方案

5倍维罗纳尔缓冲盐水（VBS）的制备

1. 为配制巴比妥缓冲盐溶液（VBS），需分别配制三种不同的溶液。
2. 配制溶液1：将21.25 g NaCl和0.94 g戊巴比妥钠溶解于350 ml蒸馏水中，NaCl和戊巴比妥钠的终浓度分别为1.02 M和13 mM。
3. 配制溶液2：将1.44 g巴比妥溶解于125 ml热蒸馏水中，巴比妥的终浓度为62.5 mM。
4. 配制溶液3：将20.33 g MgCl₂和4.41 g CaCl₂溶解于100 ml蒸馏水中，MgCl₂和CaCl₂的终浓度分别为2.18 M和440 mM。
5. 将溶液1和溶液2混合，并冷却至室温。
6. 待混合溶液冷却后，加入1.25 ml溶液3，并用1 M HCl调节pH至7.3–7.5。
7. 用蒸馏水定容至500 ml，得到5×储存液。
8. 配制1×工作液时，将储存液按1:5比例用蒸馏水稀释。

羊红细胞与溶血素的致敏

1. 首先用 VBS 将溶血素按 1:50 比例稀释，以制备溶血素溶液
2. 向 4 ml 绵羊红细胞（SRBC）中加入 6 ml VBS，并通过倒置轻轻混匀
3. 以 600g 离心 5 分钟
4. 弃去上清....

讨论

CH₅₀ 测定法易受多种因素干扰。某些绵羊红细胞（SRBC）比其他细胞更脆弱，可发生与补体活性无关的自发性溶血。兔抗体的亲和力因批次和生产厂家不同而存在差异，这会影响结合到 SRBC 上的抗体数量。此外，用抗体致敏 SRBC 的过程会导致每个 SRBC 表面抗体包被量不均一。标本的采集与储存也是潜在误差的重要来源。补体成分（如 C1q、C3、C4 和 C5）极不稳定，因此正确的样本处理至关重要。长时间暴露于高温会降低补体活性，并产生补体成分的失活片段。为了尽可能检测出各种误差来源，每次进行测定时都必须使用已知 CH₅₀ 值的对照血清，并应重复验证该对照血清的已知值是否在可接受范围内。确定不同批次 SRBC 和溶血素之间是否存在差异的一种方法是：多次用新的试验材料对一份标准血清样本进行检测，然后判断基础溶血水平或对照血清的 CH₅₀ 值是否发生改变。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
绵羊红细胞	CSL	2490201	终浓度使用1%
血清			人血清
兔抗绵羊溶血性血清（红细胞），未结合	AbD Serotec	C12HSB
96孔平底板	Sarstedt Ltd	83.1839
巴比妥缓冲盐水			终浓度使用1x
水浴箱
酶标仪
37°C 培养箱/孵育器