测定血清50%溶血补体（CH50）活性

摘要

经典途径由抗体激活，最终导致靶细胞裂解。CH₅₀ 测定法用于评估血清样本的补体活性。本视频演示了测定血清样本 CH₅₀ 值的实验步骤、相关计算及结果解读。

摘要

补体系统是一组蛋白质，激活后可导致靶细胞裂解，并通过调理作用促进吞噬作用。虽然可以定量各个补体成分，但这并不能提供有关通路活性的任何信息。CH₅₀是用于检测经典补体途径激活的筛选实验（图1），该实验对途径中任何组分的减少、缺失和/或失活均具有敏感性。CH₅₀检测血清补体经典途径组分裂解预先包被兔抗羊红细胞抗体（溶血素）的羊红细胞（SRBC）的功能能力。当抗体包被的SRBC与待测血清孵育时，补体的经典途径被激活，从而导致溶血。如果某一补体组分缺失，则CH₅₀水平将为零；如果经典途径的一个或多个组分减少，则 CH₅₀将会降低。向每种血清稀释液中加入固定体积的最适致敏绵羊红细胞（SRBC）。孵育后，将混合物离心，并通过在540 nm处测定上清液中释放的血红蛋白吸光度来量化溶血程度。通过检测不同稀释度待测血清裂解抗体包被SRBC的能力，确定补体活性水平。本视频概述了分析经典补体途径补体活性水平所涉及的实验步骤。

方案

5倍维罗纳尔缓冲盐水（VBS）的制备

1. 为配制巴比妥缓冲盐溶液（VBS），需分别配制三种不同的溶液。
2. 配制溶液1：将21.25 g NaCl和0.94 g戊巴比妥钠溶解于350 ml蒸馏水中，NaCl和戊巴比妥钠的终浓度分别为1.02 M和13 mM。
3. 配制溶液2：将1.44 g巴比妥溶解于125 ml热蒸馏水中，巴比妥的终浓度为62.5 mM。
4. 配制溶液3：将20.33 g MgCl₂和4.41 g CaCl₂溶解于100 ml蒸馏水中，MgCl₂和CaCl₂的终浓度分别为2.18 M和440 mM。
5. 将溶液1和溶液2混合，并冷却至室温。
6. 待混合溶液冷却后，加入1.25 ml溶液3，并用1 M HCl调节pH至7.3–7.5。
7. 用蒸馏水定容至500 ml，得到5×储存液。
8. 配制1×工作液时，将储存液按1:5比例用蒸馏水稀释。

羊红细胞与溶血素的致敏

1. 首先用 VBS 将溶血素按 1:50 比例稀释，以制备溶血素溶液
2. 向 4 ml 绵羊红细胞（SRBC）中加入 6 ml VBS，并通过倒置轻轻混匀
3. 以 600g 离心 5 分钟
4. 弃去上清液，并将细胞再洗涤 2 次
5. 最后一次洗涤后，以 900g 离心 5 分钟，使细胞充分沉淀
6. 弃去上清液，加入足量 VBS 重悬细胞，制备成 10% 的细胞悬液，即 0.5 ml 压积细胞重悬于 5 ml 缓冲液中
7. 在持续旋涡搅拌下，逐滴加入与细胞体积相等的溶血素（兔抗绵羊红细胞抗体）
8. 在 30°C 水浴中孵育 30 分钟
9. 每 15 分钟轻轻混匀细胞一次
10. 致敏后的 SRBC 可在 4°C 下保存过夜

CH₅₀ 测定

1. 将一系列试管分别以 1:8、1:16、1:32、1:64 和 1:128 的比例进行双份标记。
2. 在 VBS 中对对照血清和待测血清分别进行双份的两倍系列稀释。
3. 从 1:4 开始（100 µL 血清 + 300 µL VBS），将 200 µL 样品转移至下一个已标记的试管中。
4. 每次稀释后充分混匀，并使用新的移液器吸头将 200 µL 转移至下一稀释管中。
5. 重复此步骤，直至完成全部五个稀释度。
6. 从最终的 1:128 稀释管中弃去 200 µL。
7. 向所有试管中各加入 200 µL 悬浮的致敏 SRBC。
8. 另标记两支独立试管为 空白（BLANK），并加入 200 µL 致敏 SRBC 和 200 µL VBS。这些试管用于测定 SRBC 在 VBS 中的自发溶血。
9. 再标记另外两支独立试管为 完全溶血（TOTAL LYSIS），并加入 200 µL 致敏 SRBC 和 200 µL 蒸馏水。
10. 轻轻混匀所有试管。
11. 在 37°C 水浴中孵育 30 分钟，于 15 分钟时轻轻混匀一次。
12. 以 1,500 ×g 离心 5 分钟，使红细胞沉淀。
13. 将每支试管中的 100 µL 上清液转移至 96 孔平底板的各个孔中。
14. 向每个孔中加入 100 µL 蒸馏水。
15. 使用酶标仪在 540 nm 波长下读取样品的吸光度。

计算

1. 计算每个样本的平均吸光度
2. 从所有样本中减去空白对照吸光度（自发性裂解）
3. 使用以下公式计算每个稀释度的裂解百分比：
   
4. 以裂解百分比为纵轴，血清稀释倍数为横轴作图。
5. 计算对照血清和待测血清达到50%溶血所需的稀释倍数（图2）。

代表性结果：

视频中包含代表性结果的示例。实际操作中，需同时运行对照血清与待测血清，并以相同方式处理。下表（表1）为一份待测血清样本的示例数据。该数据根据5.3节中给出的公式进行计算处理。

样品	OD540	平均值
空白	0.042, 0.044	0.043
完全裂解	0.183, 0.183	0.183
稀释倍数	OD540	平均值	平均值-空白	裂解率%
1:8	0.200, 0.219	0.210	0.168	116
1:16	0.179, 0.173	0.176	0.134	93
1:32	0.134, 0.110	0.122	0.08	55
1:64	0.053, 0.066	0.059	0.017	12
1:128	0.044, 0.045	0.045	0.003	2

图1. 经典补体途径的激活。 经典途径通过结合在靶细胞表面的免疫球蛋白M（IgM）或免疫球蛋白G（IgG）而被激活。抗体的Fc区结合C1q，激活C1r，进而激活另一个C1r分子，两者共同激活两个C1s分子。活化的C1s切割C4，暴露出C2的结合位点，C2也被切割。C4b与C2a结合形成一种称为C3转化酶的复合物。该复合物进一步切割C3，生成C3a和C3b，其中部分C3b与C3转化酶结合，形成C5转化酶。该复合物作用于C5，产生的C5b与C6结合，启动膜攻击复合物（MAC）的形成。C5b6作用于C7，继而作用于C8，并最终作用于C9，形成最终的MAC。（Goldsby et al, 2003）。

图2. 样品数据的绘图及对照与待测血清样本CH50的计算。 （A）对照（•）和待测（）血清样本的计算裂解百分比（%）随稀释倍数的变化曲线。（B）为计算50%裂解率，从50%处画一水平线与曲线相交，再从交点垂直向下画线至横轴稀释倍数。本示例中，对照血清需稀释35倍、待测血清需稀释21.6倍方可达到50%裂解。该结果表明，待测血清中的补体含量较对照血清低，因其在较低稀释倍数下即达到50%裂解。对照样本还显示 > 1:8 稀释时溶血率为 100%。这很可能是因为蒸馏水对 SRBC 的溶血作用不完全，而补体成分的溶血作用更高效。

讨论

CH₅₀ 测定法易受多种因素干扰。某些绵羊红细胞（SRBC）比其他细胞更脆弱，可发生与补体活性无关的自发性溶血。兔抗体的亲和力因批次和生产厂家不同而存在差异，这会影响结合到 SRBC 上的抗体数量。此外，用抗体致敏 SRBC 的过程会导致每个 SRBC 表面抗体包被量不均一。标本的采集与储存也是潜在误差的重要来源。补体成分（如 C1q、C3、C4 和 C5）极不稳定，因此正确的样本处理至关重要。长时间暴露于高温会降低补体活性，并产生补体成分的失活片段。为了尽可能检测出各种误差来源，每次进行测定时都必须使用已知 CH₅₀ 值的对照血清，并应重复验证该对照血清的已知值是否在可接受范围内。确定不同批次 SRBC 和溶血素之间是否存在差异的一种方法是：多次用新的试验材料对一份标准血清样本进行检测，然后判断基础溶血水平或对照血清的 CH₅₀ 值是否发生改变。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
绵羊红细胞	CSL	2490201	终浓度使用1%
血清			人血清
兔抗绵羊溶血性血清（红细胞），未结合	AbD Serotec	C12HSB
96孔平底板	Sarstedt Ltd	83.1839
巴比妥缓冲盐水			终浓度使用1x
水浴箱
酶标仪
37°C 培养箱/孵育器