利用表现出组织和器官特异性光敏色素缺陷的转基因植物，正在研究空间特异性光敏色素响应的分子基础。通过荧光激活细胞分选技术分离出光敏色素生色团耗竭的特定细胞，随后进行微阵列分析，以鉴定参与空间特异性光敏色素响应的基因。
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摘要
摘要
光在植物整个生命周期中调节多种发育和适应性过程。植物利用称为光感受器的吸光分子来感知并适应光环境。其中，吸收红光/远红光的光敏色素光感受器已被广泛研究。在所有已研究的高等植物系统中，光敏色素以蛋白家族的形式存在，具有独特且部分重叠的功能。1. 从种子萌发到开花和衰老的光敏色素介导的光反应，通常局限于特定的植物组织或器官2. 尽管通过突变分析已发现并阐明了光敏色素的个别功能及其冗余性，但关于介导空间特异性光敏色素反应的明确光感知位点以及局部光敏色素分子机制的研究报道仍十分有限。我们基于以下假设设计了实验：特定的光敏色素光感知位点调控光形态建成中组织和器官特异性的过程，且局部的光敏色素库在细胞间信号传导中激活不同的下游靶基因子集。我们开发了一种生化方法，可在转基因植物中以器官或组织特异性的方式选择性降低功能性光敏色素的水平。本研究采用双组分增强子捕获策略，通过转录激活因子GAL4激活上游激活序列（UAS）元件控制下的基因表达。3. 胆绿素还原酶（biliverdin reductase,BVR) 在UAS-BVR亲本中，受UAS调控的基因在没有GAL4转录激活的情况下保持沉默状态4. UAS-BVR 转基因品系与 GAL4-GFP 增强子捕获品系之间的遗传杂交可导致特定表达的BVR由标记细胞中的基因GFP表达4. 拟南芥植株中BVR的积累导致光敏色素生色团缺乏in planta5-7因此，我们所培育的转基因植物表现出依赖于GAL4的激活BVR基因，导致光敏色素的生化失活，以及GAL4依赖性GFP表达。光生物学和分子遗传学分析BVR转基因品系正在揭示与相应光感知位点相关的组织和器官特异性光敏色素介导的响应4, 7, 8. 荧光激活细胞分选（FACS）分离GFP阳性、增强子捕获诱导的BVR-表达的植物原生质体结合通过微阵列分析进行的细胞类型特异性基因表达谱分析，正被用于鉴定参与介导空间特异性光敏色素反应的潜在下游靶基因。该研究正在拓展我们对光感知位点的认识，揭示不同组织或器官在光调控植物生长发育过程中的协同机制，并推动对复杂的光敏色素介导的细胞间信号级联进行分子解析。
方案
1. 植物生长
- 按照所述方法筛选获得已确认的 UAS-BVR X GAL4-GFP 增强子捕获品系4（汇总见图1），同时播种野生型或亲本品系于土壤中，即每个品系播种约 2000 粒灭菌种子。
- 将植株在土壤中生长 5 周，培养条件为：22 °C、70% 湿度下，以 100 μmolm-2s-1 的白光照射。
2. 叶片原生质体分离（改编自 Denecke 和 Vitale9）
- 为分离原生质体，配制 TEX 缓冲液。配制 1 升 TEX 缓冲液时，称取以下组分：3.1 克 Gamborg's B5 盐、0.5 克 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES，2.56 mM）、0.75 克二水合氯化钙（CaCl2·2H2O，6.75 mM）、0.25 克硝酸铵（NH4NO3，3.12 mM）、136.9 克蔗糖（0.4 M）。将各组分完全溶解于约 900 毫升去离子蒸馏水（ddH2O）中，用 1 M KOH 调节 pH 至 5.7。定容至 1 升，并使用连接真空泵的 0.2 μm 瓶顶滤器过滤除菌。
- 从植物上采集绿色健康叶片（约 250 毫升叶片松散装入烧杯中），用约 40 毫升 ddH2O 洗涤 4 次，再用无菌 ddH2O 洗涤 2 次。使用 #20 手术刀片将叶片切成细条，将组织均分至两个 50 毫升无菌塑料离心管中。通过将 5 毫升 10 倍叶片消化储备液（10 倍叶片消化储备液：将 2% w/v Macerozyme R-10 和 4% w/v Cellulase "Onozuka" R-10 溶于 TEX 缓冲液中，用 0.2 μm 滤器过滤除菌，并将 5 毫升分装液于 -80 °C 冻存）加入 45 毫升新鲜 TEX 缓冲液中，配制成 1 倍叶片消化混合液。每管加入约 25 毫升 1 倍消化混合液，确保完全浸没叶片组织。
- 将装有叶片组织和消化混合液的敞口离心管置于真空干燥器中，在室温下抽真空处理 1 小时，随后在摇床上室温孵育 3 小时，轻柔振荡。在此过程中，将装有叶片组织的加盖离心管用铝箔包裹，避免光照。
- 3 小时后，提高摇床转速约 2 分钟，以释放原生质体。将粗原生质体悬液通过两层无菌纱布过滤，去除碎片，并将滤液收集至无菌玻璃烧杯中。再将滤液通过无菌 100 μm 尼龙滤网过滤至无菌培养皿中。收集穿滤液并转移至新的无菌 50 毫升离心管中。使用约 15–20 毫升新鲜 TEX 缓冲液冲洗无菌培养皿，回收附着在表面的任何原生质体。
- 使用水平转子离心机，在 10 °C 下以 100×g 离心 15 分钟（加速度 6，减速度 0）分离穿滤液。
- 使用连接蠕动泵的无菌 9 英寸玻璃巴斯德吸管，小心吸除漂浮原生质体层下方约 25–30 毫升液体（其中含有残留及沉淀的碎片），避免扰动漂浮的原生质体层，保留约 10–15 毫升体积。
- 轻轻重悬原生质体，同时加入新鲜 TEX 缓冲液至终体积为 40 毫升。
- 重复步骤 2.5 至 2.7 两次，以尽可能去除细胞碎片。第一次重复时离心时间缩短至 10 分钟，最后一次重复时缩短至 5 分钟。
- 使用剪口的无菌 1 毫升移液吸头将漂浮的原生质体吸出，转移至新的 15 毫升离心管中。可立即进行分选，或在 4 °C 避光保存最多 2 小时后再进行分选。
3. 通过荧光激活细胞分选（FACS）进行原生质体分选
- 分选前，使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）并以488 nm激光激发，观察原生质体，以确认原生质体的完整性以及原生质体群体中绿色荧光蛋白（GFP）荧光的存在。需尽量减少碎片，以避免堵塞流式细胞分选（FACS）喷嘴。
- 在TEX缓冲液中通过流式细胞分选仪（BD FACSVantage SE，BD Biosciences）对分离的原生质体进行分选，使用200 μm喷嘴的宏观分选头，事件速率为6,000至15,000，系统压力约为9 psi，参照改进的实验方案10。
- 使用野生型非GFP原生质体确定自发荧光阈值。
- 为收集GFP阳性原生质体，使用气冷式氩离子激光器（Spectra Physics Model 177，Newport Corporation，Irvine，CA）在488 nm氩谱线、100 mW功率下运行，通过530/30带通滤光片检测GFP荧光，进行细胞分选。
- 收集GFP阳性原生质体后，按照步骤3.1所述方法，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检查已分选的原生质体。
- 使用Qiagen RNeasy植物微型试剂盒从分选后的原生质体中提取总RNA。随后可按照Affymetrix GeneChip表达分析技术手册中的描述制备cDNA，并将其杂交至AtH1拟南芥Affymetrix全基因组芯片。
代表性结果
通过流式细胞术（FACS）在GFP通道中检测到大量GFP阳性细胞（图2）。在使用GFP增强子捕获亲本进行的优化实验中，组成型表达GFP的品系J0571显示出约17%至24%的GFP阳性原生质体，而具有维管和表皮表达特性的品系J1071则含有约1.4%的GFP阳性原生质体（表1）。对J0571原生质体进行3次500 μl（总计约1.5 ml原生质体悬浮液）的分选，耗时1小时，获得约100,000个GFP阳性原生质体。对J1071原生质体进行3次500 μl（总计约1.5 ml原生质体悬浮液）的分选，耗时1.5小时，获得约3,000个GFP阳性原生质体。共聚焦图像显示，在分选前，J0571和J1071样品的原生质体产量均非常高（图3C和3E），而分选后的组分仅包含强GFP荧光的原生质体（图3G及未显示数据）。该结果证实，完整的GFP阳性原生质体可通过FACS进行分选。非GFP原生质体也可在另一通道中被分选并收集。非GFP原生质体可作为理想的阴性对照，用于后续微阵列分析，以检测全光敏色素水平降低时基因表达的特异性变化。从分离的原生质体（1 ml）中提取的RNA量足以通过荧光分光光度法检测（图4）。分离的RNA使用NanoDrop仪器（NanoDrop 1000，Thermo Scientific）进行评估，并通过NanoDrop 3.7.1 RNA定量软件进行定量。来自分选前C24野生型原生质体或经FACS分选的GFP阳性增强子捕获原生质体的RNA产量均超过微阵列RNA标记实验所需的最低20 ng（表2）。
| 增强子捕获品系 | GFP阳性原生质体百分比 | 分选获得的GFP阳性原生质体数量 |
| J0571 | 17.18 % ~ 24.06 % | 26,400 ~ 36,000 |
| J1071 | ~ 1.43 % | 1,000 ~ 1,300 |
表1. 两株增强子捕获系在分选前GFP阳性原生质体的百分比，以及将500 μL原生质体悬液通过流式细胞分选仪（FACSVantage, BD）后收集到的GFP阳性原生质体数量。
| 植物品系 | RNA 产量 (ng) |
| C24 WT | 12486.5 |
| J0571 | 60 |
| J1071 | 71.5 |
表2. 原生质体RNA分离的得率。从预分选的C24野生型或两个增强子捕获品系中分选出的GFP阳性原生质体中提取RNA，并进行定量。
图1. 基于GAL4增强子捕获系统在转基因拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株中诱导胆绿素还原酶（BVR）表达。（A）从基于GAL4的增强子捕获品系文库中筛选出的单个品系，该文库包含一个GAL4响应性GFP标记基因，可与含有GAL4响应性目标基因的品系杂交，从而在GAL4存在的细胞中诱导目标基因的表达，并通过GFP荧光进行标记。图示改编自Jim Haseloff博士（http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html）。（B）亲本品系中光敏色素发色团——光敏素胆绿素（PΦB）及全光敏色素的生成过程。（C）左图：胆绿素还原酶（BVR）活性将胆绿素IXα（BV IXα）和PΦB分别还原为胆红素（BR）和PΦR。BVR活性导致PΦB减少，从而降低光敏性全光敏色素的生成量。右图：BVR催化的反应过程。
图 2. 荧光激活细胞分选（FACS）获取的散点图。C24 野生型（A）、J0571（B）和 J1071（C）原生质体细胞分选的比较。（A）C24 野生型非 GFP 荧光原生质体的散点图，由 488 nm 氩激光激发，用于确定自发荧光阈值。（B）和（C）散点图显示原生质体在 488 nm 激光激发下呈 GFP 阳性的比例。B 和 C 中的 R3 分选门控圈定出经荧光激活细胞分选仪（FACSVantage, BD）分选并收集的 GFP 阳性目标细胞。红色通道表示原生质体叶绿素自发荧光值，绿色通道表示 GFP 荧光值。
图3. 用于细胞分选的植物原生质体的共聚焦显微镜图像。通过荧光激活细胞分选仪（FACS）分选前（A、C、E）和分选后（G）的原生质体共聚焦激光扫描图像。B、D、F和H为微分干涉差（DIC）图像。显示了C24野生型（A、B）、J1071（C、D）和J0571（E、F、G、H）的原生质体。图像C、E和G为GFP荧光（带通505 nm - 575 nm）与自发荧光（长通650 nm）的叠加图像，激发光为488 nm激光。A至H均为63倍油镜下4次扫描的平均图像。标尺 = 10 μm。
图 4. 通过荧光分光光度法对原生质体中分离的 RNA 进行定量。RNA 提取自 (A) C24 野生型，(B) J0571 和 (C) J1071。A 表示预分选野生型原生质体的 RNA。B 和 C 表示通过荧光激活细胞分选（FACS）筛选出的 GFP 阳性原生质体的 RNA。RNA 定量软件 NanoDrop 3.7.1（NanoDrop 1000，Thermo Scientific）。
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讨论
通过微阵列进行的基因表达谱分析表明：（1）拟南芥幼苗中超过30%的基因受光调控11；（2）已鉴定出大量编码参与光敏色素信号级联的光信号转导蛋白的基因12, 13。这些实验表明，光可诱导基因表达发生快速且长期的变化。每类光敏色素群体可能仅控制部分发育和适应性反应。此外，下游信号组分很可能以细胞和组织特异性的方式与光敏色素相互作用2, 14, 15。
靶向表达BVR可导致下游候选基因的表达上调或下调。通过比较UAS-BVR与GAL4-GFP杂交后代及其亲本系中基因表达的变化，我们可以鉴定出由局部光敏色素缺乏所引起的特异性基因表达改变。根据基因表达谱，可鉴定出编码参与光敏色素介导的细胞间信号传导的正向和负向调控因子的基因。近期研究表明，植物组织原生质体化可诱导数百种转录本的表达16。因此，微阵列分析的理想阴性对照是从分选过程中获得的非GFP原生质体中提取的RNA。利用这些对照可排除因植物组织原生质体化所诱导的转录本，从而鉴定出特异性参与组织和器官特异性光敏色素信号传导和/或响应的靶...
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致谢
蒙哥马利实验室在植物光敏色素反应方面的研究工作得到了美国国家科学基金会（资助号 MCB-0919100，授予 B.L.M.）以及美国能源部科学办公室基础能源科学办公室化学科学、地球科学和生物科学部（资助号 DE FG02 91ER20021，授予 B.L.M.）的支持。我们感谢梅丽莎·惠特克在拍摄过程中提供的技术协助以及对稿件的审阅，感谢斯蒂芬妮·科斯蒂根提供的实验协助，感谢路易斯·金博士在拟南芥原生质体分选的荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting）方案开发与优化方面的帮助，以及梅琳达·弗雷姆博士在共聚焦显微镜方面的协助。我们还感谢玛琳·卡梅隆在图形设计方面的协助，以及凯伦·伯德在编辑方面的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗BVR抗体 | QED Bioscience Inc. | 56257-100 | |
| 纤维素酶 “Onozuka” R-10 | SERVA Electrophoresis | MSPC 0930 | |
| Gamborg’s B5基础盐混合物 | Sigma-Aldrich | G5768 | |
| 离析酶R-10 | SERVA Electrophoresis | PTC 001 | |
| MES，低含水量 | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Murashige和Skoog盐 | Caisson Laboratories | 74904 | |
| Phytablend | Caisson Laboratories | 28302 | |
| RNeasy植物小量试剂盒 | Qiagen | 16419 |
参考文献
- Franklin, K. A., Quail, P. H. Phytochrome functions in Arabidopsis development. J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).
- Montgomery, B. L. Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development. Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).
- Laplaze, L. GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).
- Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana. , Submitted Forthcoming.
- Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell. , 675-688 (1997).
- Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Detection of spatial-specific phytochrome responses using targeted expression of biliverdin reductase in Arabidopsis. Plant Physiol. 149, 424-433 (2009).
- Warnasooriya, S. N., Porter, K. J., Montgomery, B. L. Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana. , Submitted Forthcoming.
- Denecke, J., Vitale, A. The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system. Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).
- Birnbaum, K. Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines. Nat. Methods. 2, 615-619 (2005).
- Ma, L. Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways. Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).
- Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. Light signal transduction in higher plants. Annu. Rev. Genet. 38, 87-117 (2004).
- Ulm, R., &, N. agy, F, Signalling and gene regulation in response to ultraviolet light. Curr. Opin. Plant Biol. 8, 477-482 (2005).
- Ma, L. Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development. Plant Physiol. 138, 80-91 (2005).
- Neff, M. M., Fankhauser, C., &, C. hory, J, Light: an indicator of time and place. Genes Dev. 14, 257-271 (2000).
- Birnbaum, K. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
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