利用表现出组织和器官特异性光敏色素缺陷的转基因植物，正在研究空间特异性光敏色素响应的分子基础。通过荧光激活细胞分选技术分离出光敏色素生色团耗竭的特定细胞，随后进行微阵列分析，以鉴定参与空间特异性光敏色素响应的基因。
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摘要
摘要
光在植物整个生命周期中调节多种发育和适应性过程。植物利用称为光感受器的吸光分子来感知并适应光环境。其中，吸收红光/远红光的光敏色素光感受器已被广泛研究。在所有已研究的高等植物系统中，光敏色素以蛋白家族的形式存在，具有独特且部分重叠的功能。1. 从种子萌发到开花和衰老的光敏色素介导的光反应，通常局限于特定的植物组织或器官2. 尽管通过突变分析已发现并阐明了光敏色素的个别功能及其冗余性，但关于介导空间特异性光敏色素反应的明确光感知位点以及局部光敏色素分子机制的研究报道仍十分有限。我们基于以下假设设计了实验：特定的光敏色素光感知位点调控光形态建成中组织和器官特异性的过程，且局部的光敏色素库在细胞间信号传导中激活不同的下游靶基因子集。我们开发了一种生化方法，可在转基因植物中以器官或组织特异性的方式选择性降低功能性光敏色素的水平。本研究采用双组分增强子捕获策略，通过转录激活因子GAL4激活上游激活序列（UAS）元件控制下的基因表达。3. 胆绿素还原酶（biliverdin reductase,BVR) 在UAS-BVR亲本中，受UAS调控的基因在没有GAL4转录激活的情况下保持沉默状态4. UAS-BVR 转基因品系与 GAL4-GFP 增强子捕获品系之间的遗传杂交可导致特定表达的BVR由标记细胞中的基因GFP表达4. 拟南芥植株中BVR的积累导致光敏色素生色团缺乏in planta5-7因此，我们所培育的转基因植物表现出依赖于GAL4的激活BVR基因，导致光敏色素的生化失活，以及GAL4依赖性GFP表达。光生物学和分子遗传学分析BVR转基因品系正在揭示与相应光感知位点相关的组织和器官特异性光敏色素介导的响应4, 7, 8. 荧光激活细胞分选（FACS）分离GFP阳性、增强子捕获诱导的BVR-表达的植物原生质体结合通过微阵列分析进行的细胞类型特异性基因表达谱分析，正被用于鉴定参与介导空间特异性光敏色素反应的潜在下游靶基因。该研究正在拓展我们对光感知位点的认识，揭示不同组织或器官在光调控植物生长发育过程中的协同机制，并推动对复杂的光敏色素介导的细胞间信号级联进行分子解析。
方案
1. 植物生长
- 按照所述方法筛选获得已确认的 UAS-BVR X GAL4-GFP 增强子捕获品系4（汇总见图1），同时播种野生型或亲本品系于土壤中，即每个品系播种约 2000 粒灭菌种子。
- 将植株在土壤中生长 5 周，培养条件为：22 °C、70% 湿度下，以 100 μmolm-2s-1 的白光照射。
2. 叶片原生质体分离（改编自 Denecke 和 Vitale9）
- 为分离原生质体，配制 TEX 缓冲液。配制 1 升 TEX 缓冲液时，称取以下组分：3.1 克 Gamborg's B5 盐、0.5 克 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES，2.56 mM）、0.75 克二水合氯化钙（CaCl2·2H2O，6.75 mM）、0.25 克硝酸铵（NH4NO3，3.12 mM）、136.9 克蔗糖（0.4 M）。将各组分完全溶解于约 900 毫升去离子蒸馏水（ddH2O）中，用 1 M KOH 调节 pH 至 5.7。定容至 1 升，并使用连接真空泵的 0.2 μm 瓶顶滤器过滤除菌。
- 从植物上采集绿色健康叶片（约 250 毫升叶片松散装入烧杯中），用约 40 ....
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讨论
通过微阵列进行的基因表达谱分析表明：（1）拟南芥幼苗中超过30%的基因受光调控11；（2）已鉴定出大量编码参与光敏色素信号级联的光信号转导蛋白的基因12, 13。这些实验表明，光可诱导基因表达发生快速且长期的变化。每类光敏色素群体可能仅控制部分发育和适应性反应。此外，下游信号组分很可能以细胞和组织特异性的方式与光敏色素相互作用2, 14, 15。
靶向表达BVR可导致下游候选基因的表达上调或下调。通过比较UAS-BVR与GAL4-GFP杂交后代及其亲本系中基因表达的变化，我们可以鉴定出由局部光敏色素缺乏所引起的特异性基因表达改变。根据基因表达谱，可鉴定出编码参与光敏色素介导的细胞间信号传导的正向和负向调控因子的基因。近期研究表明，植物组织原生质体化可诱导数百种转录本的表达16。因此，微阵列分析的理想阴性对照是从分选过程中获得的非GFP原生质体中提取的RNA。利用这些对照可排除因植物组织原生质体化所诱导的转录本，从而鉴定出特异性参与组织和器官特异性光敏色素信号传导和/或响应的靶.......
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致谢
蒙哥马利实验室在植物光敏色素反应方面的研究工作得到了美国国家科学基金会（资助号 MCB-0919100，授予 B.L.M.）以及美国能源部科学办公室基础能源科学办公室化学科学、地球科学和生物科学部（资助号 DE FG02 91ER20021，授予 B.L.M.）的支持。我们感谢梅丽莎·惠特克在拍摄过程中提供的技术协助以及对稿件的审阅，感谢斯蒂芬妮·科斯蒂根提供的实验协助，感谢路易斯·金博士在拟南芥原生质体分选的荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting）方案开发与优化方面的帮助，以及梅琳达·弗雷姆博士在共聚焦显微镜方面的协助。我们还感谢玛琳·卡梅隆在图形设计方面的协助，以及凯伦·伯德在编辑方面的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗BVR抗体 | QED Bioscience Inc. | 56257-100 | |
| 纤维素酶 “Onozuka” R-10 | SERVA Electrophoresis | MSPC 0930 | |
| Gamborg’s B5基础盐混合物 | Sigma-Aldrich | G5768 | |
| 离析酶R-10 | SERVA Electrophoresis | PTC 001 | |
| MES，低含水量 | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Murashige和Skoog盐 | Caisson Laboratories | 74904 | |
| Phytablend | Caisson Laboratories | 28302 | |
| RNeasy植物小量试剂盒 | Qiagen | 16419 |
参考文献
- Franklin, K. A., Quail, P. H. Phytochrome functions in Arabidopsis development. J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).
- Montgomery, B. L. Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development. Plant Signal Behav. 3, ....
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重印与许可
