利用FACS辅助的细胞类型特异性表达谱分析研究植物组织和器官特异性的光敏色素反应 拟南芥

摘要

利用表现出组织和器官特异性光敏色素缺陷的转基因植物，正在研究空间特异性光敏色素响应的分子基础。通过荧光激活细胞分选技术分离出光敏色素生色团耗竭的特定细胞，随后进行微阵列分析，以鉴定参与空间特异性光敏色素响应的基因。

摘要

光在植物整个生命周期中调节多种发育和适应性过程。植物利用称为光感受器的吸光分子来感知并适应光环境。其中，吸收红光/远红光的光敏色素光感受器已被广泛研究。在所有已研究的高等植物系统中，光敏色素以蛋白家族的形式存在，具有独特且部分重叠的功能。¹. 从种子萌发到开花和衰老的光敏色素介导的光反应，通常局限于特定的植物组织或器官². 尽管通过突变分析已发现并阐明了光敏色素的个别功能及其冗余性，但关于介导空间特异性光敏色素反应的明确光感知位点以及局部光敏色素分子机制的研究报道仍十分有限。我们基于以下假设设计了实验：特定的光敏色素光感知位点调控光形态建成中组织和器官特异性的过程，且局部的光敏色素库在细胞间信号传导中激活不同的下游靶基因子集。我们开发了一种生化方法，可在转基因植物中以器官或组织特异性的方式选择性降低功能性光敏色素的水平。本研究采用双组分增强子捕获策略，通过转录激活因子GAL4激活上游激活序列（UAS）元件控制下的基因表达。³. 胆绿素还原酶（biliverdin reductase,BVR) 在UAS-BVR亲本中，受UAS调控的基因在没有GAL4转录激活的情况下保持沉默状态⁴. UAS-BVR 转基因品系与 GAL4-GFP 增强子捕获品系之间的遗传杂交可导致特定表达的BVR由标记细胞中的基因GFP表达⁴. 拟南芥植株中BVR的积累导致光敏色素生色团缺乏in planta^5-7因此，我们所培育的转基因植物表现出依赖于GAL4的激活BVR基因，导致光敏色素的生化失活，以及GAL4依赖性GFP表达。光生物学和分子遗传学分析BVR转基因品系正在揭示与相应光感知位点相关的组织和器官特异性光敏色素介导的响应^{4, 7, 8}. 荧光激活细胞分选（FACS）分离GFP阳性、增强子捕获诱导的BVR-表达的植物原生质体结合通过微阵列分析进行的细胞类型特异性基因表达谱分析，正被用于鉴定参与介导空间特异性光敏色素反应的潜在下游靶基因。该研究正在拓展我们对光感知位点的认识，揭示不同组织或器官在光调控植物生长发育过程中的协同机制，并推动对复杂的光敏色素介导的细胞间信号级联进行分子解析。

方案

1. 植物生长

1. 按照所述方法筛选获得已确认的 UAS-BVR X GAL4-GFP 增强子捕获品系⁴（汇总见图1），并将野生型或亲本品系播种于土壤中，即每个品系播种约 2000 粒经灭菌的种子。
2. 将植株在土壤中生长 5 周，培养条件为：22 °C、70% 湿度下，以 100 μmolm^-2s^-1 的白光照射。

2. 叶片原生质体分离（改编自 Denecke 和 Vitale⁹）

1. 为分离原生质体，需配制 TEX 缓冲液。配制 1 升 TEX 缓冲液时，称取以下组分：3.1 克 Gamborg's B5 盐、0.5 克 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES，2.56 mM）、0.75 克二水氯化钙（CaCl₂·2H₂O，6.75 mM）、0.25 克硝酸铵（NH₄NO₃，3.12 mM）、136.9 克蔗糖（0.4 M）。将上述组分完全溶解于约 900 毫升去离子蒸馏水（ddH₂O）中，用 1 M KOH 调节 pH 至 5.7，定容至 1 升，并使用连接真空泵的 0.2 μm 瓶顶滤器过滤除菌。
2. 从植物上采集绿色健康叶片（约 250 毫升叶片松散装入烧杯中），用约 40 毫升 ddH₂O 漂洗 4 次，再用无菌 ddH₂O 漂洗 2 次。使用 #20 手术刀片将叶片切成细条，均分至两个 50 毫升无菌塑料离心管中。通过将 5 毫升 10 倍叶片消化储备液（10 倍储备液：将 2% w/v Macerozyme R-10 和 4% w/v Cellulase "Onozuka" R-10 溶于 TEX 缓冲液中，用 0.2 μm 滤器过滤除菌后分装为 5 毫升每份，于 -80 °C 冻存）加入 45 毫升新鲜 TEX 缓冲液中，配制成 1 倍叶片消化液。每管加入约 25 毫升 1 倍消化液，确保完全浸没叶片组织。
3. 将装有叶片组织和 1 倍消化液的敞口离心管置于真空干燥器中，连接水泵进行真空渗透处理 1 小时（室温），随后在摇床中室温孵育 3 小时，轻柔振荡。此过程中，将离心管密封后用铝箔包裹，避免光照。
4. 孵育 3 小时后，提高摇床转速约 2 分钟以释放原生质体。将粗制原生质体悬液通过两层无菌纱布过滤，去除残渣，并将滤液收集至无菌玻璃烧杯中。再将滤液通过无菌 100 μm 尼龙滤网过滤至无菌培养皿中。收集穿过滤网的液体并转移至新的无菌 50 毫升离心管中。使用约 15–20 毫升新鲜 TEX 缓冲液冲洗培养皿，回收附着于表面的原生质体。
5. 将滤过液在 10 °C 条件下，以 100×g 离心力用水平转子离心 15 分钟（加速度设为 6，减速度设为 0）。
6. 使用连接蠕动泵的无菌 9 英寸玻璃巴斯德吸管，小心移除漂浮原生质体层下方约 25–30 毫升液体（含残留及沉淀的残渣），注意不扰动漂浮的原生质体层，保留约 10–15 毫升液体体积。
7. 轻轻重悬原生质体，加入新鲜 TEX 缓冲液至终体积为 40 毫升。
8. 重复步骤 2.5 至 2.7 两次，以尽可能去除细胞残渣。第一次重复时离心时间缩短至 10 分钟，最后一次缩短至 5 分钟。
9. 用剪去尖端的无菌 1 毫升移液器吸取漂浮的原生质体，转移至新的 15 毫升离心管中。可立即进行分选，或于 4 °C 避光保存最多 2 小时后再进行分选。

3. 通过荧光激活细胞分选（FACS）进行原生质体分选

1. 分选前，使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）并以488 nm激光激发，观察原生质体，确认原生质体的完整性以及原生质体群体中绿色荧光蛋白（GFP）荧光的存在。需尽量减少碎片，以避免堵塞流式细胞分选（FACS）喷嘴。
2. 在TEX缓冲液中通过流式细胞分选仪（BD FACSVantage SE，BD Biosciences）对分离的原生质体进行分选，使用配备200 μm喷嘴的大型分选头，事件速率为6,000至15,000，系统压力约为9 psi，参照已优化的实验方案¹⁰。
3. 使用野生型非GFP原生质体确定自发荧光阈值。
4. 为收集GFP阳性原生质体，采用空气冷却的氩离子激光器（Spectra Physics Model 177，Newport Corporation，Irvine，CA），在488 nm氩谱线处以100 mW功率运行，通过530/30带通滤光片检测GFP荧光，进行细胞分选。
5. 收集GFP阳性原生质体后，按照步骤3.1所述方法，通过CLSM检查已分选的原生质体。
6. 使用Qiagen RNeasy植物小型试剂盒从分选后的原生质体中提取总RNA。随后可按照Affymetrix GeneChip表达分析技术手册中的描述制备cDNA，并将其杂交至AtH1拟南芥Affymetrix全基因组芯片。

代表性结果

通过流式细胞术（FACS）在GFP通道中检测到大量GFP阳性细胞（图2）。在使用GFP增强子捕获亲本进行的优化实验中，组成型表达GFP的品系J0571显示出约17%至24%的GFP阳性原生质体，而具有维管和表皮表达特性的品系J1071则含有约1.4%的GFP阳性原生质体（表1）。对J0571原生质体进行3次500 μl（总计约1.5 ml原生质体悬浮液）的分选，持续1小时，可获得约100,000个GFP阳性原生质体。对J1071原生质体进行3次500 μl（总计约1.5 ml原生质体悬浮液）的分选，持续1.5小时，可获得约3,000个GFP阳性原生质体。共聚焦图像显示，在分选前，J0571和J1071样品的原生质体产量均非常高（图3C和3E），而分选后的组分仅包含强GFP荧光的原生质体（图3G及未显示数据）。该结果证实，完整的GFP阳性原生质体可通过FACS进行分选。非GFP原生质体也可在另一通道中被分选并收集。非GFP原生质体可作为理想的阴性对照，用于后续微阵列分析，以检测全光敏色素水平降低时基因表达的特异性变化。从分离的原生质体（1 ml）中提取的RNA量足以通过荧光分光光度法检测（图4）。分离的RNA使用NanoDrop仪器（NanoDrop 1000，Thermo Scientific）进行评估，并通过NanoDrop 3.7.1 RNA定量软件进行定量。来自分选前C24野生型原生质体或经FACS分选的GFP阳性增强子捕获原生质体的RNA产量均超过微阵列RNA标记实验所需的最低20 ng（表2）。

增强子捕获品系	GFP阳性原生质体百分比	分选的GFP阳性原生质体数量
J0571	17.18 % ~ 24.06 %	26,400 ~ 36,000
J1071	~ 1.43 %	1,000 ~ 1,300

表1. 两个增强子捕获品系在分选前GFP阳性原生质体的百分比，以及通过流式细胞分选仪（FACSVantage，BD）运行500 μL原生质体悬液后收集到的GFP阳性原生质体数量。

植物品系	RNA 产量 (ng)
C24 WT	12486.5
J0571	60
J1071	71.5

表2. 原生质体RNA提取的产量。从预分选的C24野生型或两个增强子捕获品系中分选得到的GFP阳性原生质体中提取RNA，并进行定量。

图1. 基于 GAL4 增强子捕获系统的转基因拟南芥（Arabidopsis thaliana）中胆绿素还原酶（BVR）表达的诱导。（A）从基于 GAL4 的增强子捕获品系文库中筛选出的单个品系，该文库包含 GAL4 响应性GFP标记基因，可与含有 GAL4 响应性目标基因的品系杂交，从而在表达 GAL4 并由 GFP 荧光标记的细胞中诱导目标基因的表达。改编自 Jim Haseloff 博士（http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html）。（B）亲本品系中光敏色素生色团——植物光敏素胆绿素（PΦB）及全光敏色素的生成。（C）左图：胆绿素还原酶（BVR）催化胆绿素 IXα（BV IXα）和 PΦB 分别还原为胆红素（BR）和 PΦR。BVR 活性导致 PΦB 减少，从而降低光敏活性全光敏色素的生成量。右图：BVR 催化的反应过程。

图2. 荧光激活细胞分选（FACS）获取的点图。C24野生型（A）、J0571（B）和J1071（C）原生质体细胞分选的比较。（A）C24野生型原生质体在488 nm氩激光激发下无GFP荧光的获取点图，用于确定自发荧光阈值。（B）和（C）获取点图显示了在488 nm激光激发下GFP阳性的原生质体比例。B和C中的R3分选门限定出由荧光激活细胞分选仪（FACSVantage, BD）分选并收集的GFP阳性目标细胞。红色通道表示原生质体叶绿素自发荧光值，绿色通道表示GFP荧光值。

图3. 用于细胞分选的植物原生质体的共聚焦显微镜图像。通过荧光激活细胞分选仪（FACS）分选前（A，C，E）和分选后（G）的原生质体的共聚焦激光扫描图像。B、D、F 和 H 为微分干涉差（DIC）图像。显示了C24野生型（A，B）、J1071（C，D）和J0571（E，F，G，H）的原生质体。图像C、E 和 G 是由488 nm激光激发获得的GFP荧光（带通505 nm - 575 nm）与自发荧光（长通650 nm）的叠加图像。A至H均为63倍油镜下4次扫描的平均图像。标尺 = 10 μm。

图4. 通过荧光分光光度法对原生质体中分离的RNA进行定量分析。RNA提取自（A）C24野生型，（B）J0571，以及（C）J1071。A代表预分选野生型原生质体的RNA。B和C代表通过荧光激活细胞分选（FACS）筛选出的GFP阳性原生质体的RNA。RNA定量分析软件为NanoDrop 3.7.1（NanoDrop 1000，Thermo Scientific）。

讨论

通过微阵列进行的基因表达谱分析表明：（1）拟南芥幼苗中超过30%的基因受光调控¹¹；（2）已鉴定出大量编码参与光敏色素信号级联的光信号转导蛋白的基因^{12, 13}。这些实验表明，光可诱导基因表达发生快速且长期的变化。每类光敏色素群体可能仅控制部分发育和适应性反应。此外，下游信号组分很可能以细胞和组织特异性的方式与光敏色素相互作用^{2, 14, 15}。

靶向表达BVR可导致下游候选基因的表达上调或下调。通过比较UAS-BVR与GAL4-GFP杂交后代及其亲本系中基因表达的变化，我们可以鉴定出由局部光敏色素缺乏所引起的特异性基因表达改变。根据基因表达谱，可鉴定出编码参与光敏色素介导的细胞间信号传导的正向和负向调控因子的基因。近期研究表明，植物组织原生质体化可诱导数百种转录本的表达¹⁶。因此，微阵列分析的理想阴性对照是从分选过程中获得的非GFP原生质体中提取的RNA。利用这些对照可排除因植物组织原生质体化所诱导的转录本，从而鉴定出特异性参与组织和器官特异性光敏色素信号传导和/或响应的靶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗BVR抗体	QED Bioscience Inc.	56257-100
纤维素酶 “Onozuka” R-10	SERVA Electrophoresis	MSPC 0930
Gamborg’s B5基础盐混合物	Sigma-Aldrich	G5768
离析酶R-10	SERVA Electrophoresis	PTC 001
MES，低含水量	Sigma-Aldrich	M3671
Murashige和Skoog盐	Caisson Laboratories	74904
Phytablend	Caisson Laboratories	28302
RNeasy植物小量试剂盒	Qiagen	16419