在本视频中，我们演示了小鼠囊胚的分离以及从囊胚中建立滋养层干细胞的方法。同时介绍了维持干细胞特性的培养条件，以及在体外诱导其分化的方案。
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本文内容
摘要
摘要
滋养层的特化是哺乳动物发育过程中最早的分化事件之一。源自滋养外胚层的滋养层细胞系介导胚胎着床，并形成胎盘的胎儿部分。因此，该细胞系的发育对胚胎存活至关重要。从小鼠囊胚中分离滋养层干细胞（TS细胞）最早由Tanaka报道等1998年。滋养层干细胞（TS细胞）在适当刺激后能够维持滋养层特有的特性，并表达特定发育阶段和细胞类型的标志物，这为研究滋养层谱系发育及模拟早期胎盘形成过程提供了一个有价值的模型系统。此外，滋养层细胞是少数经历自然基因组扩增的体细胞类型之一。尽管调控滋养层多倍体化的分子通路已开始被揭示，但滋养层基因组扩增的生理功能及其优势仍尚不明确。在体外培养中，二倍体干细胞向多倍体滋养层细胞的转变使这一ex vivo系统成为阐明健康与疾病中基因组复制及其不稳定性调控机制的优秀工具。本文所述方案基于此前发表的文献报道，并参考了Chiu等人发表的改进方法等2008年
方案
在本实验方案中，我们描述了小鼠囊胚的制备以及滋养层干细胞系的建立。在收集囊胚之前的小鼠操作，包括自然交配的设置和超数排卵的诱导，基本遵循Nagy et al. 2003（第146–150页）所述的标准方案。
滋养层干细胞的分离与培养
- 设置目标小鼠之间的交配繁殖组合。
- 制备小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为饲养层细胞。在囊胚收集前两天，将 MEFs（2 × 106 个细胞）接种于 100 mm 培养皿中。次日，用含有丝裂霉素 C（20 mg/ml）的 10 ml TS 培养基在 37°C、5% CO2 条件下孵育 2 小时处理细胞。随后用 PBS 洗涤细胞两次。将经丝裂霉素 C 处理的细胞接种至 12 孔板（每孔 1 × 105 个细胞）。
- 在囊胚收集当天（胚胎发育第 3.5 天，记为第一天），将 MEF 培养基更换为含 1× FGF4/肝素的 TS 培养基（每孔 0.5 ml）。
- 准备子宫组织的收集：处死小鼠并定位子宫（图 1A）。
- 用镊子夹住子宫颈（位于膀胱后方）以摘除子宫，并在子宫与子宫颈连接处剪断（图 1B）。拉出子宫，去除膜和脂肪组织，并在子宫与输卵管连接处下方剪断（图 1C）。将子宫（图 1D）置于 60 mm 培养皿中，加入少量（0.2 ml）TS 培养基。
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讨论
在本视频中，我们演示了从子宫中收集E3.5囊胚以及建立滋养层干细胞（TS细胞）系的实验操作流程。我们还介绍了维持TS细胞干性以及诱导其分化为成熟细胞的培养条件。获得纯化TS细胞系的两个关键步骤是：囊胚贴壁后组织块解离的时机（步骤9）以及首次传代处理（步骤11）。已有报道指出，在步骤9中若囊胚贴壁生长过度，或在步骤11中TS细胞集落过度生长（>50%融合度），培养中可能出现原始内胚层来源的细胞（Kunath等，2005）。尽管原始内胚层来源的细胞可通过其独特的形态特征（如细胞呈圆形、细胞间接触减少）与TS细胞相区分，但由于这些细胞在TS培养基中生长良好，且似乎无需MEF饲养层或FGF4因子支持，因此很难从培养体系中彻底清除。
即使在含有MEF-CM和FGF4的条件下，TS细胞培养中仍可能持续产生已分化的TGCs。若需要获得纯的TS细胞群体，可根据其贴壁速度的差异来分离这些已分化的细胞。与MEFs类似，TGCs贴附于培养皿的速度快于TS细胞，因此可通过第13步所述方法获得纯化的TS细胞群体。另外，由于TGCs具有高度贴壁性且对胰蛋白酶消化更具抗性，也可通过短时间胰蛋白酶消化（3.......
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致谢
作者感谢Janet Rossant提供的原始实验方案。本研究由美国国立卫生研究院基金CA106308资助WH。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| TS 培养基： RPMI-1640，20% 胎牛血清，1 mM 丙酮酸钠，100 mM β-巯基乙醇–乙醇和100 mg/ml青霉素-链霉素 | |||
| 丝裂霉素C： 将 2 mg 丝裂霉素 C（Sigma M-0503）溶解于 2 ml PBS 中，将此 2 ml 混合液加入 200 ml TS 培养基中（终浓度 10 ng/ml）。分装为 20 份（每份 10 ml），于 -20 ℃ 保存°C 保存至使用。每 100 mm 培养皿加入一份等分试样。 | |||
| 小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（MEF-CM）： 将MEFs接种于100 mm培养皿中（1 × 10⁶细胞/皿）6/孔）。次日，每皿加入10 ml TS培养基，继续培养48小时。收集培养液，经0.45 μm滤器过滤后，于-20℃保存。°C，分装成35 ml每份。根据需要解冻每份，解冻后可在4°C. 胚胎成纤维细胞（MEF）在汇合前还可用于制备两批条件培养基。 | |||
| PBS/BSA： 将牛血清白蛋白（BSA，第五组分，Sigma A3311，0.1% (w/v)）溶于 PBS（10 ml）中，经 0.45 mm 注射器滤器过滤，分装为每管 1 ml 至 1.5 ml 离心管中。于 -70 ℃ 保存°根据需要解冻一管以制备 FGF4。 | |||
| FGF4（1000倍）： 将冻干的 FGF4（Sigma F8424，25 mg）用 1 ml PBS/BSA 溶液重悬。充分混匀后，分装为 10 份（每份 100 μl）至 1.5 ml 离心管中，于 -70 °C 保存°C. 根据需要解冻每管，并将剩余的保存在 4°C，切勿重新冷冻。用TS培养基稀释1000倍，得到1× FGF4（25 ng/ml）。 | |||
| 肝素（1000 倍）： 将肝素（Sigma H3149，10,000 单位）用 PBS 溶解，配制成终浓度为 1 mg/ml（1000 倍）的溶液。分装成每管 100 μl 至 1.5 ml 离心管中，于 -70 °C 保存°C. 根据需要解冻分装样品，其余部分储存于 4°C，切勿再次冷冻。用 TS 培养基稀释 1000 倍，得到 1x 肝素（1 ng/ml）。 |
参考文献
- Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &, Hsu, W. SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages. PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).
- Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J.
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