在本视频中,我们演示了小鼠囊胚的分离以及从囊胚中建立滋养层干细胞的方法。同时介绍了维持干细胞特性的培养条件,以及在体外诱导其分化的方案。
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在本视频中,我们演示了小鼠囊胚的分离以及从囊胚中建立滋养层干细胞的方法。同时介绍了维持干细胞特性的培养条件,以及在体外诱导其分化的方案。
在本实验方案中,我们描述了小鼠囊胚的制备以及滋养层干细胞系的建立。在收集囊胚之前的小鼠操作,包括自然交配的设置和超数排卵的诱导,基本遵循Nagy et al. 2003(第146–150页)所述的标准方案。
滋养层干细胞的分离与培养
冻存滋养层干细胞
解冻滋养层干细胞
滋养层干细胞向滋养层巨细胞的分化
通过去除MEF-CM、FGF4和肝素可诱导TS细胞向滋养层巨细胞(TGCs)分化。诱导后四天可检测到TGC表型(大细胞核)(Tanaka et al., 1998 和 Chiu 等 2008)。对p450scc进行免疫染色可检测到该滋养层巨细胞(TGC)标志物在分化培养物中的表达(图4A)。对碘化丙啶(PI)染色细胞进行流式细胞术分析进一步显示,存在DNA含量更高的分化细胞(图4B)。这些结果表明,滋养层干细胞(TS细胞)通过内复制过程转变为多倍体TGCs。
代表性结果

图1. 小鼠子宫的解剖。(A)箭头所示为子宫的位置。(B)按图示在子宫与宫颈连接处横向剪开。(C)在卵巢(OV)下方、输卵管(OD)下方稍低位置剪开子宫。(D)子宫的图像。

图2. 代表性图像展示小鼠囊胚、囊胚孵出及滋养层细胞集落。(A)显示在E3.5时获取的小鼠囊胚。ICM,内细胞团;MT,壁滋养外胚层;PT,极滋养外胚层。(B)显示在MEF饲养层上的滋养层细胞孵出物。TS,滋养层干细胞。(C)滋养层干细胞集落在MEF饲养层上具有清晰的边界。箭头指示细胞边界。

图3. 通过免疫染色分析鉴定TS细胞。TS细胞(A-D)和ES细胞(对照,E-H)进行标志物鉴定。细胞经抗体免疫染色以检测Oct4(A,E)或Cdx2(B,F),并用DAPI复染(C,G),合并图像如(D,H)所示。比例尺,50 μm。

图4. TS细胞体外分化。(A)培养中的未分化(未分化)或已分化(分化)细胞经检测TGC标志物p450scc(绿色)的表达情况,并用DAPI复染(红色)。(B)经PI染色的已分化细胞进行流式细胞术分析,测定其DNA含量(M1:2至4个拷贝;M2:超过4个拷贝)。M2群体代表多倍体滋养层细胞。
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在本视频中,我们演示了从子宫中收集E3.5囊胚以及建立滋养层干细胞(TS细胞)系的实验操作流程。我们还介绍了维持TS细胞干性以及诱导其分化为成熟细胞的培养条件。获得纯化TS细胞系的两个关键步骤是:囊胚贴壁后组织块解离的时机(步骤9)以及首次传代处理(步骤11)。已有报道指出,在步骤9中若囊胚贴壁生长过度,或在步骤11中TS细胞集落过度生长(>50%融合度),培养中可能出现原始内胚层来源的细胞(Kunath等,2005)。尽管原始内胚层来源的细胞可通过其独特的形态特征(如细胞呈圆形、细胞间接触减少)与TS细胞相区分,但由于这些细胞在TS培养基中生长良好,且似乎无需MEF饲养层或FGF4因子支持,因此很难从培养体系中彻底清除。
即使在含有MEF-CM和FGF4的条件下,TS细胞培养中仍可能持续产生已分化的TGCs。若需要获得纯的TS细胞群体,可根据其贴壁速度的差异来分离这些已分化的细胞。与MEFs类似,TGCs贴附于培养皿的速度快于TS细胞,因此可通过第13步所述方法获得纯化的TS细胞群体。另外,由于TGCs具有高度贴壁性且对胰蛋白酶消化更具抗性,也可通过短时间胰蛋白酶消化(3...
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作者感谢Janet Rossant提供的原始实验方案。本研究由美国国立卫生研究院基金CA106308资助WH。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| TS 培养基: RPMI-1640,20% 胎牛血清,1 mM 丙酮酸钠,100 mM β-巯基乙醇–乙醇和100 mg/ml青霉素-链霉素 | |||
| 丝裂霉素C: 将 2 mg 丝裂霉素 C(Sigma M-0503)溶解于 2 ml PBS 中,将此 2 ml 混合液加入 200 ml TS 培养基中(终浓度 10 ng/ml)。分装为 20 份(每份 10 ml),于 -20 ℃ 保存°C 保存至使用。每 100 mm 培养皿加入一份等分试样。 | |||
| 小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基(MEF-CM): 将MEFs接种于100 mm培养皿中(1 × 10⁶细胞/皿)6/孔)。次日,每皿加入10 ml TS培养基,继续培养48小时。收集培养液,经0.45 μm滤器过滤后,于-20℃保存。°C,分装成35 ml每份。根据需要解冻每份,解冻后可在4°C. 胚胎成纤维细胞(MEF)在汇合前还可用于制备两批条件培养基。 | |||
| PBS/BSA: 将牛血清白蛋白(BSA,第五组分,Sigma A3311,0.1% (w/v))溶于 PBS(10 ml)中,经 0.45 mm 注射器滤器过滤,分装为每管 1 ml 至 1.5 ml 离心管中。于 -70 ℃ 保存°根据需要解冻一管以制备 FGF4。 | |||
| FGF4(1000倍): 将冻干的 FGF4(Sigma F8424,25 mg)用 1 ml PBS/BSA 溶液重悬。充分混匀后,分装为 10 份(每份 100 μl)至 1.5 ml 离心管中,于 -70 °C 保存°C. 根据需要解冻每管,并将剩余的保存在 4°C,切勿重新冷冻。用TS培养基稀释1000倍,得到1× FGF4(25 ng/ml)。 | |||
| 肝素(1000 倍): 将肝素(Sigma H3149,10,000 单位)用 PBS 溶解,配制成终浓度为 1 mg/ml(1000 倍)的溶液。分装成每管 100 μl 至 1.5 ml 离心管中,于 -70 °C 保存°C. 根据需要解冻分装样品,其余部分储存于 4°C,切勿再次冷冻。用 TS 培养基稀释 1000 倍,得到 1x 肝素(1 ng/ml)。 |
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