体内检测微图案化表面的蛋白质-蛋白质相互作用

摘要

本视频展示了利用微图案化表面进行蛋白质-蛋白质相互作用实验及后续分析的方法。该方法能够在活细胞中检测蛋白质相互作用，兼具高通量能力与获取定量信息的优势。

摘要

揭示分子间相互作用网络体内对于理解调控细胞功能和代谢的机制至关重要。目前已开发出多种用于研究细胞内分子相互作用的方法，但大多数方法较为间接，因此难以实现准确定量。相反，尽管已有一些高端的定量技术被引入，但这些技术难以扩展到高通量应用。为了将高通量能力与获取定量信息的可能性相结合，我们近期提出了一种新的蛋白质-蛋白质相互作用鉴定概念（Schwarzenbacher）等., 2008)。在此，我们描述了一种详细的方案，用于设计和构建该系统，该系统可用于分析荧光标记蛋白（“猎物”）与膜蛋白（“诱饵”）之间的相互作用。体内细胞被接种在包被有针对诱饵蛋白胞外域抗体的微图案化表面上。通过荧光标记的捕获蛋白的重新分布来检测诱饵-捕获物之间的相互作用。该方法具有高灵敏度，可达到单分子水平，能够检测弱相互作用，并具备高通量能力，因此可作为筛选工具使用。

方案

微接触印刷：

1. 使用手术刀切割出PDMS印章上的微图案区域
2. 用乙醇（100%）和蒸馏水冲洗含有微图案的区域进行清洗
3. 用氮气或氩气吹干PDMS印章
4. 将50 μl BSA-Cy5工作溶液（0.67 mg/ml）移液至PDMS印章上，确保整个微图案区域被溶液覆盖，室温孵育30分钟
5. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）和蒸馏水冲洗微图案区域
6. 用氮气或氩气吹干PDMS印章
7. 将PDMS印章自然放置于一片环氧涂层盖玻片中央，在培养皿中室温孵育30分钟，仅依靠其自身重量贴合
8. 在盖玻片背面标记PDMS印章的位置，并用镊子将印章从玻片上剥离
9. 在盖玻片的微接触印刷区域上覆盖一个Secure Seal杂交腔室，标记有助于定位该区域的中心
10. 向反应腔室中加入60 μl链霉亲和素工作溶液（50 μg/ml），室温孵育60分钟
11. 通过向腔室的一个端口加入1 ml PBS缓冲液，同时用泵从第二个端口同步移除液体，对样品进行洗涤
12. 向反应腔室中加入60 μl生物素化抗体工作溶液（10 μg/ml，溶于含0.1% Tween 20的PBS缓冲液中，即“PBST”），室温孵育60分钟
13. 先用1 ml PBST，再用1 ml PBS缓冲液依次洗涤样品，每次均通过向一个端口加液，同时用泵从另一端口移除液体
14. 将制备好的微图案表面保存在PBS中，避光、室温存放，直至细胞准备接种

将细胞孵育于微图案化表面：

1. 在3 cm的组织培养皿中将贴壁细胞培养至50%汇合度。
2. 使用乙二胺四乙酸（EDTA）溶液消化表达目标诱饵蛋白和猎物蛋白的细胞，并在1,000 rpm转速下离心5分钟。
3. 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于相应的生长培养基中。
4. 在1,000 rpm转速下离心5分钟。
5. 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于适当的生长培养基中。
6. 用60 μl细胞悬液替换微图案盖玻片反应腔中的PBS。
7. 通过将无菌垫浸入蒸馏水中并放入培养皿内，构建一个加湿环境，以防止样品干燥。
8. 将细胞在37 °C、5% CO₂的环境中于微图案表面过夜孵育。
9. 在显微镜下分析细胞前，将培养基更换为含有Ca²⁺和Mg²⁺的Hank's平衡盐溶液。

显微镜技术：

1. 将盖玻片置于合适的载物台上，在白光下检查细胞形态。
2. 通过647 nm激发检测BSA-Cy5图案的质量。
3. 在全内反射（TIR）激发下，于488 nm或514 nm处记录荧光捕食蛋白（GFP或YFP）的微图案。

代表性结果：

如果在微图形化表面上培养的细胞中目标蛋白之间存在相互作用，则捕获蛋白将跟随诱饵蛋白的重新分布。由此产生的微图形可通过捕获蛋白的荧光标记进行可视化。重要的是，所获得的对比度可直接反映相互作用的强度（见图1）。因此，无需进一步处理测得的原始数据，即可简单地评估两种蛋白之间的相互作用。

图1. 不同相互作用强度下活细胞质膜中诱饵分子的重排。显示了转染了以下成分的T24细胞的全内反射（TIR）图像：(a) CD71-GFP与抗CD71抗体，(b) CD4与胞质YFP与抗CD4抗体，以及(c) GPI-GFP-DAF与抗CD59抗体微阵列。这些数据分别代表强相互作用（a）、无相互作用（b）或弱相互作用（c）。(a) 改编自（Weghuber et al., in press），(b) 改编自（Schwarzenbacher et al., 2008）。

讨论

配套视频演示了一种用于检测活细胞质膜中蛋白质-蛋白质相互作用的方法（Schwarzenbacher et al., 2008; Brameshuber et al., 2009; Weghuber et al., in press）。原则上，任何基于全内反射荧光（TIRF）的显微镜平台均可用作检测系统。只有在需要高灵敏度时（例如检测单个分子），才需使用先进的显微镜设备。为获得最佳结果，在制备过程中需特别注意以下关键步骤：

1. 将Cy5储备液在避光条件下保存，以防止荧光染料漂白，并在微接触印刷前新鲜配制BSA-Cy5工作溶液。
2. 使用移液器枪头时注意不要划伤PDMS上的微图案，并将样品在避光条件下孵育，以防止荧光染料漂白。
3. 将盖玻片置于无菌垫上，以防止玻片粘附到培养皿上。一旦PDMS印章粘附到玻片上，就不要再移动。
4. 避免反应室中产生气泡，并将样品在避光条件下孵育，以防止荧光染料漂白。
5. 不要让样品干燥超过2分钟，以避免盐晶体形成。
6. 在细胞解离过程中不要使用胰蛋白酶，因为它会切割已表达的膜蛋白的胞外结构域。避免使用胰蛋白酶有助于低周转率蛋白在细胞贴附到表面后立即形成微图案。
7. 在显微镜下控制孵育的细胞数量，确保细胞融合度不超过30–50%。由于细胞在抗体包被的表面上贴附迅速，必须立即去除过量的细胞。
8. 只有具有高质量BSA-Cy5图案的玻片才能用于后续分析。
9. 由于每扫描可分析的细胞数量更多，稳定表达荧光捕获蛋白更为理想。
10. 由于存在胞质背景信号，适当的全内反射荧光（TIRF）调节对于可视化图案至关重要。

微图案技术为蛋白质-蛋白质相互作用的分析提供了多种可能性。首先，该技术不仅能够对局部的、空间分辨的蛋白质-蛋白质相互作用进行定量分析，还能检测弱相互作用或间接相互作用，且不会带来假阳性或假阴性结果过多的问题。其次，该技术使研究者能够在活细胞的质膜环境中分析蛋白质-蛋白质相互作用，而这一点通过酵母双杂交等生化方法难以实现。第三，该方法可用于检测受环境变化（如温度、不同蛋白质或其他分子的存在，以及翻译后修饰）调控的诱饵-猎物相互作用。因此，该检测方法可在活细胞背景下筛选特定相互作用对的调节因子。此外，通过降低捕获配体的表面密度或使用单价配体，还可实现对静息状态的分析。最后，若采用适当的扫描平台，所分析的细胞数量足以满足制药公司在药物筛选中对高通量的需求（Ramm, 2005）。