啮齿类动物模型中治疗中枢神经系统疾病的全身与局部药物递送

摘要

对作用于中枢神经系统的药物进行全面的临床前测试，通常需要评估和比较不同给药途径下的药物生物分布。本文在小鼠中展示了三种常用的全身给药方法（静脉注射、腹腔注射和口服）以及一种局部给药方法（对流增强输送）。

摘要

中枢神经系统（CNS）治疗药物的充分临床前测试需考虑给药途径及药物在体内的分布情况，以评估其治疗效果。在主要的两类给药方式——局部给药与系统性给药中，系统性给药因操作简便而常被优先选择。然而，系统性给药可能导致CNS内药物浓度未达理想水平，从而对药物疗效得出错误结论。局部给药方法虽更具侵入性，但可能是实现治疗性药物浓度所必需的手段。本文展示了三种系统性给药途径的规范操作技术：静脉注射、腹腔注射和口服灌胃。此外，我们还介绍了一种向脑部进行局部给药的方法：对流增强输送（convection-enhanced delivery, CED）。实验中使用了荧光标记化合物以 体内 成像及药物给药准确性的验证。本方法以小鼠模型展示，但可轻松适用于大鼠。

方案

1. 全身给药方法

尽管全身给药并非在中枢神经系统（CNS）中实现高药物浓度的最有效方法，但全身给药操作便捷，且易于被患者接受。本文将演示三种常规使用的全身给药方法的正确操作步骤：静脉注射、腹腔注射和口服灌胃。

A. 静脉注射（尾静脉注射）

1. 在开始操作前，应记录每只小鼠的体重。与所有临床前研究一样，应定期（每周两次或更频繁）监测体重，以评估潜在的药物毒性。单次注射体积不得超过小鼠体重的1%。例如，对于20 g的小鼠，注射液体量不应超过0.2 mL。所有静脉注射的液体均应通过适当方法灭菌。
2. 使用加热垫或加热灯将小鼠加热5–10分钟，以扩张尾静脉。若使用加热灯，需全程密切监测小鼠，避免发生高热。
3. 将小鼠转移至固定装置中，该装置可限制小鼠活动，同时便于接触尾静脉（参见视频）。小鼠尾巴上可见四条血管：背侧和外侧的血管为静脉，腹侧的血管为动脉。为进入尾静脉，应握住小鼠尾巴最远端，并旋转90度，使静脉朝上。用酒精棉片清洁注射部位，将28号胰岛素注射针头斜面朝上插入静脉（参见视频）。若针头正确进入静脉，则推进时应无阻力且可自由移动。以均匀压力在5–10秒内缓慢注射药物。若尾部出现水疱，应立即停止注射，这表明针头已脱离静脉。
4. 注射后，对注射部位施加轻柔压力，直至出血停止，通常需要30–60秒。注射后应观察小鼠5–10分钟，确保无持续出血。

B. 腹腔注射

1. 在开始注射前，应将药物装入连接28g针头的注射器中。确保注射器内有足够空间用于注射前回抽活塞（例如，若注射200μL，应确保注射器容量为300μL或更大）。
2. 抓住小鼠尾巴将其从笼中取出，并放置于有纹理的表面上，以便小鼠能够抓握。通常使用笼盖即可。让小鼠伸展身体后，用非惯用手捏住其背部皮肤，注意用拇指、食指和中指尽可能多地轻轻捏起皮肤（见视频）。将小鼠翻转，使其腹部朝上。若小鼠头部仍可自由活动，请松开并重新抓握，以避免注射过程中被咬伤。
3. 用惯用手拿起注射器，以30度角将针头插入小鼠左下腹区域（见视频）。轻微倒置小鼠有助于使内脏器官远离注射部位。为确认针头位于腹膜腔内，回抽注射器活塞。若注射器内出现液体或血液，则说明针头未进入腹膜腔，应拔出针头。若未抽吸到任何液体，则在1-5秒内以均匀压力注入注射器内容物，随后释放小鼠。
4. 注射后观察小鼠5-10分钟，确保其恢复至正常活动水平。

C. 口服灌胃

1. 开始注射前，记录小鼠的体重。经口灌胃给药的最大体积为每千克体重10 mL。例如，一只20 g小鼠的最大给药体积为200 μL。尝试注入更大体积可能导致反流，从而造成给药不完全。如果必须给予超过上述体积的药液，可在24小时内分次给药，最多给予三次。
2. 为避免刺穿食管，必须为每只小鼠测量灌胃针的长度。将一根18G球头弯曲灌胃针的一端置于小鼠最后一根肋骨处，然后用永久性记号笔在针上标记小鼠头部前端的位置（见视频）。在进行灌胃操作时，该标记将作为插入针头时的停止点。
3. 使用与腹腔注射相同的手法固定小鼠。将灌胃针从口腔插入，越过舌面，经咽部推进。切勿将针插入超过标记的停止点。针头应顺畅推进，无需施加压力（见视频）。若遇到阻力，应立即停止并撤出针头，以避免将液体注入肺部。
4. 针头到位后，在1–5秒内缓慢推动活塞完成给药，然后以与插入时相同的角度取出针头。给药后观察小鼠5–10分钟，密切注意是否有呼吸困难等迹象，这些可能是液体进入肺部的表现。

2. 局部递送

急性对流增强给药

A. 探针构建

目前尚无商用的抗反流CED套管用于啮齿类动物。本文将介绍一种套管构建方法，该方法改编自Krauze et al（Krauze 2005）首次描述的方法。

• 套管由三个部分组成（图1）：一段直径为100 µm的石英管，用于输送灌注液；一根刚性金属针，提供结构支撑；一段柔性特氟龙管，用于加载灌注液。
• 获取刚性金属针的方法：用明火熔化 Surflo IV 导管（24g 导丝）上的塑料部分，用镊子取出金属针，其余导管部分可丢弃。使用单刃剃刀片截取一段稍长于金属针的石英管（外径 0.163 mm）。将石英管在少量氰基丙烯酸酯快速粘合剂（例如 Krazy Glue）的小液滴中滚动，注意不要让粘合剂沾到石英管两端。将石英管插入金属针中，静置干燥5分钟。
• 干燥后，石英管应牢固地固定在金属针上。修剪石英管两端，使针尖端伸出2 mm石英管，平端伸出3 mm石英管（见视频）。
• 截取一段20 cm长的特氟龙管。将金属针在少量粘合剂中滚动，再次注意避免粘合剂沾到石英管两端，以免堵塞套管。将金属针插入特氟龙管1 cm深，静置干燥1分钟。使用热熔胶枪，在金属针与特氟龙管连接处滴加一滴热熔胶（见视频），确保连接处四周完全覆盖，并至少干燥1小时。套管可提前一周制备，室温下储存。

B. 输注操作步骤

• 准备手术区域时，应使用消毒剂（如 2% 氯己定溶液）喷洒所有表面。操作过程中应佩戴无菌外科手套。随后用吸水性手术巾覆盖表面。以下物品应放置于手术区域内：
  • 用于维持小鼠体温的加热垫
  • 两个小型培养皿；一个盛有 3% 过氧化氢，另一个盛有 2% 氯己定
  • 无菌纱布和棉签
  • 无菌一次性手术刀（21 号）
  • 无菌 22 号针头
  • 小鼠立体定位仪
  • 可控速率注射泵
  • 经高压灭菌的小鼠皮肤缝合器、缝合钉及拆钉器
• 安装 CED 插管时，使用塑料注射器接头将 1 mL 注射器连接至聚四氟乙烯（Teflon）管路。应将插管固定在立体定位仪上，使其垂直于手术台面（参见视频）。为消毒插管，先用 70% 乙醇充满 1 mL 注射器，推动活塞使乙醇流经插管。再用无菌生理盐水重复此过程，并检查插管连接处是否有泄漏。为消毒插管外表面，可用 70% 乙醇擦拭巾轻轻擦拭。
• 用无菌生理盐水充满插管，然后回抽注射器，使一小段空气泡进入插管内。该空气泡将用于分隔插管内的灌注液与生理盐水。随后进行反向加样（backload）灌注液（参见视频）。将注射器连接至注射泵，并通过短暂运行插管以预充泵管系统。
• 使用注射麻醉剂对小鼠进行镇静，并用浸有 2% 氯己定溶液的无菌纱布反复擦拭皮肤数次（每次 5–10 秒）以完成皮肤准备。应为小鼠涂抹眼膏，以在手术过程中保持眼部湿润。使用无菌手术刀沿颅骨中线做一长约 1.5 cm 的矢状切口（参见视频）。随后用浸有 3% 过氧化氢溶液的棉签清洁颅骨表面。注意避免将过氧化氢接触小鼠眼睛。此时应能清晰辨认颅骨缝线：若不可见，可用新的浸有 3% 过氧化氢溶液的棉签轻轻擦拭颅骨直至显露。
• 确定前囟（bregma）位置（图 2），从此结构向右测量 2 mm，向后测量 1 mm，以确定灌注位点。使用无菌 22 号针头，在该位置通过旋转针头轻轻在颅骨上钻孔（参见视频）。避免强行将针头向下压入颅骨。
• 此时应将小鼠置于立体定位仪中，并开始吸入麻醉（参见视频）。以低浓度（1%）给予麻醉气体，并密切监测小鼠呼吸频率变化，据此调整麻醉剂量。
• 将插管置于颅骨钻孔上方，然后将其下降至颅骨表面以下 3 mm 处。开始灌注，采用以下流速与持续时间：

  0.1 μL/min，持续 5 分钟
  0.2 μL/min，持续 5 分钟
  0.5 μL/min，持续 5 分钟
  0.8 μL/min，持续 7.5 分钟
  停止灌注，持续 1 分钟

• 灌注结束后，缓慢拔出插管，并用 3% 过氧化氢棉签擦拭颅骨。在钻孔处涂抹无菌骨蜡（参见视频）。使用镊子将皮肤拉拢覆盖颅骨，用缝合钉闭合切口。术后应给予布托啡诺以缓解疼痛。
• 术后密切观察小鼠，直至其恢复意识与活动能力。由于手术时间较长，小鼠可能需要长达一小时才能完全恢复活动。在此期间，应将小鼠笼置于加热垫上以防止低体温，并避免将恢复期小鼠与活跃小鼠同笼饲养。
• 皮肤缝合钉应在术后一周拆除。

C. 体内 成像

在对流增强递送（CED）给药后，可对荧光标记的灌注液进行成像，并监测其信号强度及信号位置的变化。通常，建议在灌注结束后等待2-3小时再进行成像，以便让小鼠从灌注过程中恢复。

• 成像过程中使用低浓度吸入性麻醉剂进行麻醉。将小鼠仰卧位固定于成像系统（例如 IVIS Lumina，Caliper Life Sciences，Alameda，CA）。根据所检测荧光染料选择合适的滤光片设置，采集图像。对于对流增强给药（CED），成功的灌注应在脑内灌注位点附近显示大部分药物分布（图 3）。

3. 典型结果

治疗给药后未出现不良反应是注射成功的重要指标。例如，尾静脉注射后，尾巴的外观（如大小、颜色）应无任何变化。若尾静脉注射后出现气泡或水疱，则表明药物被注入皮下而非静脉内。对于腹腔注射，皮肤出现隆起或腹部变色可能提示药物注入皮下或内部结构受损。在经口灌胃过程中，若小鼠出现呼吸困难或咳嗽，可能表明液体误入肺部而非胃内。

对于CED而言，神经功能评估对于判断治疗给药是否成功至关重要。若小鼠出现癫痫发作或偏瘫，可能提示灌注不当。如果使用荧光示踪剂进行灌注， 体内 成像可用于评估给药是否成功（图3如果灌注液未局限在注射部位，则表明灌注未成功。

图1：CED导管及手术装置示意图。图中显示了对流增强给药（CED）手术装置的基本组成。微输注泵（A）连接输注导管（B，顶部为放大图）。使用立体定位仪（C）固定探针位置。本图未包含手术过程中同时使用的加热装置和麻醉设备。

图 2：小鼠颅骨缝线。通过确定矢状缝与冠状缝的交点（前囟），然后从前囟向侧方测量 2 mm、向后方测量 1 mm，即可定位 CED 输注位点（红色星标）。

图3：成功 CED 的代表性结果。用远红外荧光染料标记的脂质体通过 CED 注入小鼠脑内，并进行活体成像 体内 和 离体成功的灌注表现为荧光信号定位于灌注部位 体内 （A）和 离体 （B）信号应局限于灌注半球，不得渗漏至对侧半球。

图 4：成功将CED递送至大鼠脑干的代表性图像。将荧光标记的脂质体灌注至大鼠脑干。在大鼠中，最多可将 20μL 可进行灌注。大鼠颅骨增厚以及注射深度较大，使得灌注难以实施。 体内 成像，但可通过以下方式验证输注位置是否正确 离体 解剖后脑组织的成像

讨论

任何治疗剂的临床前疗效评估都必须考虑该制剂的药理学特性及其靶向组织的特点。尽管全身给药方法通常操作更简便且患者耐受性更好，但血脑屏障的选择性通透特性常常要求在治疗中枢神经系统疾病时采用局部给药方式。本文中，我们展示了一种直接向脑组织给药的方法：对流增强递送（CED）。其他向脑部局部给药的方式还包括直接向脑脊液给药、瘤内推注注射以及脑室注射。对于这些方法而言，治疗剂的扩散能力至关重要，扩散性能差会导致药物作用范围仅限于注射部位周围几毫米的区域（Jain 1989，Bobo 1994）。相比之下，CED 利用正压来扩大药物分布区域（Bobo 1994），同时仍可实现对特定神经解剖结构的靶向递送。在我们的实验室中，已成功在啮齿类动物的脑干以及尾状壳核区域实施了 CED（图4）。

在治疗多种中枢神经系统（CNS）疾病时，为了最大限度地提高治疗效果，人们对在啮齿类动物模型中实施对流增强输送（CED）的需求日益增加。CED可用于递送多种物质，包括纯化蛋白、小分子药物以及病毒（Gill 2003，Degen 2003，Szerlip 2007）。可采用CED治疗的疾病范围涵盖中枢神经系统肿瘤（Yamashita 2007）以及帕金森病等神经退行性疾病（Gill 2003）。随着CED研究的不断拓展，对CED给药治疗过程进行活体成像的需求也在同步增长。尽管本文展示的荧光成像方法可能无法穿透人类颅骨进行观察，但其他结合磁共振成像（MRI）对比剂共输注的技术（Dickinson 2008）正受到关注，有望用于监测CNS疾病患者体内输注物的分布情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2% 氯己定	Fisher Scientific	NC9756995	又称 Nolvasan”
20 号针头	BD Biosciences	305175
28 号针头（带注射器）	Fisher Scientific	22-004-270	又称胰岛素注射器
3% 过氧化氢	Fisher Scientific	H312P-4	避光保存
棉签	Fisher Scientific	23-400-100	使用前高压灭菌
氰基丙烯酸酯类粘合剂	Fisher Scientific	NC9592632	又称 Krazy Glue”
一次性手术刀	Feather Safety Razor Co, Ltd.	2975	21 号
纱布	Fisher Scientific	22028563	使用前高压灭菌
加热垫	Dunlap	HP950
静脉导管	Fisher Scientific	14-841-20
输液泵	BASi	MD-1000, MD-1001
Living Image 软件	Caliper Life Sciences	联系获取报价
眼科软膏	Cardinal Health	1272830	又称 Akwa Tears”
塑料注射器接头	Upchurch Scientific	P-604, P-200NX, P-215X, P-630	适用于鲁尔锁式注射器
石英毛细管	Polymicro Technologies	2000020
皮肤缝合器、缝合钉、拆钉器	Stoelting Co.	59020
立体定位仪	Stoelting Co.	51725
特氟龙管	Upchurch Scientific	1520
Xenogen Lumina	Caliper Life Sciences	联系获取报价