纯化荧光蛋白的光转化及活细胞中双探针光学标记

摘要

本方案描述了在共聚焦激光扫描显微镜上进行荧光蛋白光转化的一般方法。我们介绍了纯化蛋白样品的光转化步骤，以及在活细胞中利用mOrange2和Dronpa进行双探针光学标记的实验流程。

摘要

光可转换荧光蛋白（pc-FPs）是一类具有“光学标记”能力的荧光蛋白，其荧光颜色可通过特定波长的光照进行改变。光学标记可对荧光分子的亚群进行非侵入性标记，因此非常适合用于单个细胞或细胞器的追踪。

影响高效光转化的关键参数包括光转化光源的强度和照射时间。如果光强过低，光转化将变得缓慢甚至无法发生；反之，光强过高或照射时间过长则可能导致蛋白质发生光漂白，从而降低光转化的效率。

本方案描述了如何为 pc-FP 光转化应用设置共聚焦激光扫描显微镜的一般方法。首先，我们介绍制备纯化蛋白质液滴样品的步骤。这种样品形式非常便于在显微镜下研究荧光蛋白的光物理行为。其次，我们将利用蛋白质液滴样品展示如何配置显微镜以实现光转化。最后，我们将展示如何在活细胞中进行光学标记，包括使用 mOrange2 和 Dronpa 进行双探针光学标记。

方案

1. 荧光蛋白液滴样品的制备

荧光蛋白液滴样品由含有荧光蛋白的水相与1-辛醇形成的乳状液构成，其中荧光蛋白位于水相中。该乳状液被夹在显微镜载玻片与一块22 mm见方的盖玻片之间，用于显微镜观察。

1. 在制备荧光蛋白液滴样品前，需对显微镜载玻片和盖玻片进行清洁，并涂覆疏水剂。
2. 用丙酮清洗玻璃器皿5分钟，随后自然晾干。（可选：清洁后可用等离子清洗仪处理30秒，以获得最佳的涂层效果）。
3. 在丙酮中配制2%的甲基三甲氧基硅烷溶液，将玻璃器皿浸入该溶液中孵育2分钟以完成涂覆。涂覆后将玻璃器皿从溶液中取出，自然晾干，随后用喷瓶中的70%乙醇冲洗，并再次晾干。（可选：此时可将玻璃器皿在80°C下烘烤1小时，使涂层与玻璃器皿发生共价结合）。涂覆后的玻璃器皿可至少保存一个月。
4. 荧光蛋白以His₆标签蛋白的形式从E. Coli中纯化¹。测定纯化蛋白的吸收光谱，并在STE缓冲液（150 mM NaCl，10 mM Tris-HCl pH 8，1 mM EDTA）中配制含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的储备稀释液，使其光密度约为0.1。此外，在15 ml锥形管中配制10 ml的1-辛醇与STE缓冲液1:1混合液，并剧烈混匀。混匀后静置至相分离完全。上层为1-辛醇。（注意：由于1-辛醇气味强烈，所有接触过1-辛醇的物品必须使用密闭废液容器收集）。
5. 在....

讨论

纯化的荧光蛋白液滴样品是一种非常便捷的样品形式，适用于荧光蛋白的光物理特性表征，例如研究光漂白动力学和光转化动力学。极小的液滴体积（约20皮升）有利于开展光漂白和光转化实验，而这类实验在基于比色皿的系统中往往难以实施。此外，如本文所示，液滴样品非常适用于构建共聚焦显微镜的光转化实验体系。疏水涂层和牛血清白蛋白（BSA）的存在对于获得均一液滴至关重要。若无涂层，液滴容易被压扁贴附于玻璃表面之一；若无BSA，荧光蛋白倾向于在1-辛醇/水界面处聚集，形成荧光晕环（图1）。

荧光蛋白光转化常被视为荧光漂白后荧光恢复（FRAP）的一种替代方法，其优势在于可以追踪光转化后的产物。然而，必须注意的是，光转化效果在很大程度上依赖于所使用的激光功率。过高的光转化激光功率或过长的照射时间将导致光漂白而非光转化，从而减少光转化荧光的信号量（图2）。

mOrange2 及其光转化物种的红移光谱特性允许使用绿色荧光光学标记物进行双探针光学标记。此处展示的是使用光可逆开关荧光蛋白（Dronpa），也可选择使用光激活荧光蛋白，例如 PA-GFP。Dro.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微镜载玻片	VWR international	48312-003
22 mm 盖玻片	Corning	2940-245
1-辛醇	Sigma-Aldrich	O4500
甲基三甲氧基硅烷	Sigma-Aldrich	M6420
MatTek 培养皿	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-019