本方案描述了在共聚焦激光扫描显微镜上进行荧光蛋白光转化的一般方法。我们介绍了纯化蛋白样品的光转化步骤，以及在活细胞中利用mOrange2和Dronpa进行双探针光学标记的实验流程。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
光可转换荧光蛋白（pc-FPs）是一类具有“光学标记”能力的荧光蛋白，其荧光颜色可通过特定波长的光照进行改变。光学标记可对荧光分子的亚群进行非侵入性标记，因此非常适合用于单个细胞或细胞器的追踪。
影响高效光转化的关键参数包括光转化光源的强度和照射时间。如果光强过低，光转化将变得缓慢甚至无法发生；反之，光强过高或照射时间过长则可能导致蛋白质发生光漂白，从而降低光转化的效率。
本方案描述了如何为 pc-FP 光转化应用设置共聚焦激光扫描显微镜的一般方法。首先，我们介绍制备纯化蛋白质液滴样品的步骤。这种样品形式非常便于在显微镜下研究荧光蛋白的光物理行为。其次，我们将利用蛋白质液滴样品展示如何配置显微镜以实现光转化。最后，我们将展示如何在活细胞中进行光学标记，包括使用 mOrange2 和 Dronpa 进行双探针光学标记。
方案
1. 荧光蛋白液滴样品的制备
荧光蛋白液滴样品由1-辛醇/水乳液组成，其中荧光蛋白位于水相中。该乳液被夹在显微镜载玻片与一块22 mm见方的盖玻片之间，用于显微镜观察。
- 在制备荧光蛋白液滴样品之前，需要对显微镜载玻片和盖玻片进行清洁，并用疏水剂进行包被。
- 用丙酮清洗玻璃器皿5分钟，然后自然晾干。（可选：清洁后可将玻璃器皿在等离子清洗仪中处理30秒，以获得最佳的包被效果）。
- 在丙酮中配制2%的甲基三甲氧基硅烷溶液，并将玻璃器皿浸入该溶液中孵育2分钟以完成包被。包被后将玻璃器皿从溶液中取出，自然晾干，然后用喷瓶喷洒70%乙醇冲洗，再次晾干。（可选：此时可将玻璃器皿在80°C下烘烤1小时，使包被层与玻璃器皿发生共价结合）。包被后的玻璃器皿可至少保存一个月。
- 荧光蛋白以His6标签蛋白的形式从E. Coli中纯化1。测定纯化蛋白的吸收光谱，并用STE缓冲液（150 mM NaCl，10 mM Tris-HCl pH 8，1 mM EDTA）配制蛋白储备稀释液，使其光密度值约为0.1，同时加入0.1%牛血清白蛋白（BSA）。另外，在15 ml锥形管中配制10 ml的1-辛醇与STE缓冲液1:1混合液，剧烈震荡混匀。混匀后静置至相分离完全，上层为1-辛醇。（注意：由于1-辛醇气味强烈，所有接触过1-辛醇的废弃物必须使用密闭废液容器收集）。
- 在微量离心管中加入45 μl 1-辛醇和5 μl荧光蛋白溶液以制备乳剂。用手指轻弹管壁数次以初步乳化，随后将离心管放入超声水浴中处理30秒。在此期间，准备好已包被的显微镜载玻片和盖玻片。超声处理后，乳剂应完全呈浑浊状。超声结束后立即从离心管中部吸取4 μl乳剂，滴加到已包被的显微镜载玻片上，并用已包被的盖玻片覆盖。
- 若操作正确，乳剂应在载玻片与盖玻片之间均匀铺展。数分钟内样品将趋于稳定，形成厚度约为10 μm、直径各异的荧光液滴。较大的液滴靠近样品中心，较小的液滴则分布于边缘区域。
2. 设置光转化实验
以下步骤是进行荧光蛋白光转化实验的一般策略。该方法适用于纯化的蛋白质以及活细胞。
- 以下参数可为您的光转化实验设置提供一个通用的起始点：
40倍，1.3NA油浸物镜
图像尺寸 = 512 × 512 像素
扫描缩放 = 4
像素驻留时间 = 6 μsec
Z轴分辨率（针孔大小）= 3 μm - 为初始荧光和光转化后的荧光配置两个检测通道，并设置一个“光转化通道”。在本示例中，我们将使用纯化的mOrange2蛋白，这是一种由橙色转化为红色的光转化荧光蛋白。橙色形式通过561 nm激发光检测，荧光信号收集范围为570 nm至630 nm；光转化后的红色形式通过633 nm激发光检测，荧光信号收集范围为640 nm至700 nm。对于“光转化通道”，选择488 nm激发光，并收集490 nm至540 nm之间的荧光。（注意：成像光转化通道并非绝对必要。）
- 使用初始荧光成像通道并以连续扫描方式调整激光功率和探测器增益，以获得最佳图像质量。
- 激活光转化通道，并选择较低的激光功率。开始采集时间序列图像，逐步增加光转化激光强度，直至观察到初始荧光出现明显漂白。持续扫描，直到初始荧光强度大约漂白至原来的25%。
- 关闭光转化通道，激活用于检测光转化后荧光的检测通道。以高探测器增益和低激光功率开始成像，逐步提高激光功率，直至检测到光转化后的荧光信号。一旦检测到光转化荧光，即可调整激光功率和探测器增益以获得最佳图像质量。
- 最后，需优化用于光转化的激光功率及其照射时间。提高光转化激光功率可加快光转化速率，但过高的激光功率会导致蛋白发生光漂白。
- 当确定了最佳的光转化激光功率和照射时间后，即可利用这些参数配置标准的光漂白或FRAP模块，此后不再需要“光转化通道”。
3. 使用 mOrange2 和 Dronpa 进行双探针光学标记
由于具有红移的光谱特性，mOrange2 可与绿色光可逆开关荧光蛋白 Dronpa 联合使用，进行双探针光学标记，从而实现对 4 个独立细胞（细胞器）群体的选择性标记。
- 细胞在玻璃底 MatTek 培养皿中培养，并在成像前 24 小时使用标准的 Lipofectamine2000 转染方法进行转染1。
- 按照第 2 节所述设置显微镜以进行 mOrange2 的光转化。
- 配置显微镜以实现 Dronpa 的光开关。Dronpa 荧光可使用 mOrange2 的“光转化通道”进行成像（见步骤 2.2）。注意：用于成像 Dronpa 的激光功率应尽量降低，因为过高的激光功率会导致 Dronpa 失活。添加一个用于 Dronpa 光激活的通道。我们使用 800 nm 的双光子激发进行光激活，但也可使用 405 nm 激发实现。确定 Dronpa 荧光成像、光激活和光失活所需的激光功率。
- 警告：mOrange2 的光转化和 Dronpa 的失活均可由 488 nm 激发引起。由于 mOrange2 光转化需要较高的激光功率，这将同时导致 Dronpa 荧光的失活。另一方面，Dronpa 的失活在较低激光功率下即可发生，可在不引起显著 mOrange2 光转化的情况下完成。
- 在设定好 mOrange2 光转化和 Dronpa 光开关的参数后，通过以下步骤实现双探针光学标记：首先，使用低功率 488 nm 激发使整个视野中的 Dronpa 荧光失活；其次，选择一个感兴趣区域，并使用高功率 488 nm 激发对 mOrange2 进行光转化；最后，选择另一个感兴趣区域以激活 Dronpa 荧光。
4. 代表性结果
图1. 液滴样品制备。 A) 正确制备的液滴样品。B) 未对载玻片和盖玻片进行包被处理而制备的样品。C) 未添加0.1% BSA而制备的样品。
图 2. 光转化激光功率和持续时间对 mOrange2 光转化的影响。 使用不同强度的 488 nm 激光对含有 mOrange2 蛋白的单个液滴进行连续光转化。用于光转化的相对激光功率分别为 10%（实线）、25%（虚线）和 100%（点线）。A）橙色荧光物质。B）光转化后的红色荧光物质。
图3. 使用 mOrange2 和 Dronpa 进行双探针光学标记。 A) 表达 mOrange2-Histone H2B 和 Dronpa-Mito 的细胞在光转化前的图像，显示细胞核中呈橙色荧光，线粒体中呈绿色荧光。B) 使用低功率 488 nm 激光激发关闭 Dronpa 荧光，此过程对 mOrange2 的光转化影响极小。C) 使用高功率 488 nm 激光激发将 mOrange2 光转化为红色荧光。D) 使用 800 nm 双光子激发再次激活 Dronpa 荧光。各图均为荧光图像与微分干涉差显微图像的叠加图。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
纯化的荧光蛋白液滴样品是一种非常便捷的样品形式，适用于荧光蛋白的光物理特性表征，例如研究光漂白动力学和光转化动力学。极小的液滴体积（约20皮升）有利于开展光漂白和光转化实验，而这类实验在基于比色皿的系统中往往难以实施。此外，如本文所示，液滴样品非常适用于构建共聚焦显微镜的光转化实验体系。疏水涂层和牛血清白蛋白（BSA）的存在对于获得均一液滴至关重要。若无涂层，液滴容易被压扁贴附于玻璃表面之一；若无BSA，荧光蛋白倾向于在1-辛醇/水界面处聚集，形成荧光晕环（图1）。
荧光蛋白光转化常被视为荧光漂白后荧光恢复（FRAP）的一种替代方法，其优势在于可以追踪光转化后的产物。然而，必须注意的是，光转化效果在很大程度上依赖于所使用的激光功率。过高的光转化激光功率或过长的照射时间将导致光漂白而非光转化，从而减少光转化荧光的信号量（图2）。
mOrange2 及其光转化物种的红移光谱特性允许使用绿色荧光光学标记物进行双探针光学标记。此处展示的是使用光可逆开关荧光蛋白（Dronpa），也可选择使用光激活荧光蛋白，例如 PA-GFP。Dro...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢佛罗里达州立大学的 Mike W. Davidson 提供编码荧光蛋白的质粒DNA。本研究由美国国立卫生研究院基金项目GM72048（资助给D.W.P.）支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 显微镜载玻片 | VWR international | 48312-003 | |
| 22 mm 盖玻片 | Corning | 2940-245 | |
| 1-辛醇 | Sigma-Aldrich | O4500 | |
| 甲基三甲氧基硅烷 | Sigma-Aldrich | M6420 | |
| MatTek 培养皿 | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
参考文献
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
