晚期果蝇蛹脑中的原代神经元培养

摘要

本视频展示了如何从晚期果蝇蛹脑中制备原代神经元培养物。活体培养物的图像显示了神经突的生长，以及使用Fura-2对钙离子水平进行成像。

摘要

在本视频中，我们演示了从晚期果蝇蛹脑中制备原代神经元培养物的方法。该操作始于在蛹壳形成后70-78小时的果蝇中取出脑组织。分离的脑组织经木瓜蛋白酶短暂孵育后，再用无血清生长培养基多次洗涤。视频展示了将单个脑组织置于盖玻片上5 μl培养液液滴中进行机械解离的过程。在解离过程中，有丝分裂后神经元的轴突和树突在胞体附近被剪切，但神经元在接种后数小时内即开始再生突起。图像显示了培养2天后的活细胞状态。神经元在培养的第一周内持续形成复杂的突起结构。利用GAL4品系驱动荧光标记物（如GFP或RFP）在特定组织中的表达，可在培养物中识别特定的神经元群体。全细胞记录表明，这些培养的神经元能够形成具有功能的、自发活跃的胆碱能和GABA能突触。一段短视频展示了使用钙离子指示染料Fura-2监测培养神经元中钙离子动态的过程，包括自发钙瞬变以及尼古丁诱导的钙反应。这些蛹期脑组织培养物是一种有用的研究模型系统，可用于结合遗传学与药理学工具，鉴定影响中枢突触形成与功能的内在与外在因素。 关键词：原代神经元培养，果蝇蛹脑，GAL4系统，荧光标记，GFP，RFP，木瓜蛋白酶消化，机械解离，无血清培养基，突触形成，胆碱能突触，GABA能突触，全细胞膜片钳记录，钙成像，Fura-2，钙瞬变，尼古丁反应，中枢神经系统，神经元再生，突起发育

方案

培养前的准备工作：

1. 制备无菌解剖液。
2. 制备无菌DMEM，并以10 ml分装保存于4°C，可存放2周。
3. 制备无菌DDM2添加剂，并以50或100 µl分装后冷冻保存，可存放1个月。
4. 制备ConA/层粘连蛋白溶液。
5. 包被盖玻片。
        可选：制备无菌CNBM，冷冻保存，最长可存放4个月。

培养当天

一、  在超净工作台中配制酶溶液（ES）

1. 在15 ml离心管中加入5 ml解离液（DS）。
2. 在0.6 ml离心管中称取0.8 mg L-半胱氨酸，并加入150 µl解离液（DS），反复吹打直至晶体完全溶解。
3. 将150 µl DS/半胱氨酸溶液加入5 ml DS中，并充分混匀。
4. 加入50 U（单位）木瓜蛋白酶（Papain）。
5. 加入7 ml 0.1 N NaOH，并充分混匀。激活后溶液将在30分钟内变澄清。 
6. 使用0.2 mm注射器滤器将酶溶液过滤至无菌的1.5 ml螺口微量离心管中
    
      木瓜蛋白酶（Papain）：需在5 ml DS中加入50 U。每批酶活性略有差异，因此需计算用量：
                                       浓度为37.3 mg/ml，活性为28.3 U/mg
                                        37.3 × 28.3 = 1055.59 U/ml   (1000 ml)
                                                                    50 U  = 47.4 µl
   

II. 配制 DDM2 培养基

培养当天：加入以下补充成分以配制 DDM2

在培养前，向 10 ml DMEM 中加入以下补充物：

1. 100µl 转铁蛋白
2. 100µl 腐胺
3. 100µl 硒
4. 100µl 孕酮
5. 50µl  胰岛素
6. 10µl 20-羟基蜕皮酮

注意：为所有计划的培养物制备足够的DDM2（每个脑组织置于单独的35 mm培养皿中的单个盖玻片上，每种培养物培养基体积为1.5 ml）

步骤 III 至 VI 可在非无菌实验台进行，且应在 45 分钟或更短时间内完成。

三、蛹的收集

1. 在解剖显微镜下，从培养管壁选择10-15只蛹。
2. 将蛹放置在干燥的35 mm培养皿盖中。 

注意：我们通常使用蛹化后55至78小时（APF）的蛹脑。较年轻的蛹脑较难解剖，因为其头囊容易塌陷；而较老的蛹脑神经突起生长的整体水平则略低。在Canton-S野生型品系中，这些阶段的特征是眼睛呈浅棕色至微红色，其他部位色素较少。

IV. 在解剖显微镜下进行断头

1. 在培养皿盖内靠近蛹的位置滴加两滴无菌解剖液。
2. 用左手持精细镊子轻轻夹住一只蛹，右手持连接1毫升注射器的27号针头，去除蛹体前端的角质层。
3. 用镊子轻轻挤压蛹体，当头部露出时，用27号针头切断颈部。
4. 用针头尖端或镊子将头部转移至解剖液滴中。
5. 重复上述操作，直至单滴解剖液中收集10–15个头部。

V. 在解剖显微镜下从头部取出脑组织

1. 每只手中各持一个带有27号针头的1 cc注射器。
2. 用注射器将果蝇头部置于解剖液滴中，使吻部朝向操作者，头部背侧朝北。
3. 将左侧针头插入吻部以固定头部，用右侧针头在右眼处做一个切口，切口方向从腹侧延伸至背侧。
4. 将右侧针头插入靠近左侧吻部区域，然后用左侧针头轻轻下压左眼上方的角质层，将脑组织推向右侧的切口。脑组织应相对完整地从右侧切口挤出，通常两侧视叶仍附着，有时还带有色素化的眼组织。
5. 用针头背部将脑组织推入一个新的无菌35 mm培养皿中的无菌解剖生理盐水液滴内。
6. 每种基因型收集10–15个脑组织。
   

六、视叶的切除与酶处理

1. 每只手中持有一个带27号针头的1 cc注射器，用它们将所有脑组织聚集到一滴解剖液中的小范围内
2. 将注射器用作切割工具，从每个脑组织上切除视叶，使剩余用于培养的组织为中央脑区
3. 使用20 µl移液器（设定体积为5 µl），将同一基因型的所有脑组织转移至含有1 ml无菌木瓜蛋白酶溶液的离心管中
4. 将脑组织在60 rpm转速的摇床上用木瓜蛋白酶溶液孵育10–15分钟
5. 以3000 rpm离心3分钟
   

在无菌超净工作台内——所有组织暴露于空气中的步骤，后续均应在超净工作台内进行。

七、洗涤

1. 移除酶溶液，并替换为无菌解剖液。
2. 以 3000 rpm 离心 3 分钟。
3. 用无菌解剖液总共洗涤 3 次。
4. 移除解剖盐溶液，并替换为 DDM2。
5. 用 DDM2 总共离心并洗涤 2 次。
6. 将脑组织和培养基转移至无菌的 35 mm 培养皿中。
   

八、在解剖显微镜下进行吹打和接种

1. 将5 μl DDM2置于盖玻片中央。
2. 用黄色枪头将1个脑组织转移至该滴DDM2中。
3. 在显微镜下，使用27号针头将脑组织切碎成小块（应耗时 <1 分钟。
4. 在视觉引导下，折断一根吸头的尖端  已拉制成细尖的玻璃移液管，以便将较大的组织块轻轻吸入移液管尖端，并重新排回培养基中。我们使用配有标准100 µl血细胞比容毛细玻璃管的口吸移液装置。
   
   注意：注意避免在培养基中产生气泡，且需通过实验确定最适合的移液器规格。理想的消化效果是能在约30秒/脑组织内将脑组织解离成部分单细胞和部分较大的细胞团块。在高倍镜下观察时，约有10–20%的神经元应仍保留部分突起，同时仍可见一些较大的细胞团块。若解离过度，则所有细胞将变为圆形，且因损伤严重而无法存活。该步骤需要练习，并且必须快速完成，由于组织表面积与体积比较大，DDM2液滴的渗透压和pH值会迅速变化。组织需立即置于CO₂培养箱中₂ 尽快将孵育器放回。
   
   
5. 在培养皿盖上标注：“基因型、日期和时间”。
6. 将35 mm培养皿放入100 mm培养皿中（内含湿润的吸水纸），并在CO₂培养箱中静置平衡₂ 30 分钟孵育。
7. 用 1.5 ml DDM2 充满 35 mm 培养皿。
8. 将培养物置于含5% CO₂的培养箱中培养₂ 23°C 培养箱
   
   注意：如果你无法使用冷却的CO₂培养箱₂ 培养箱，使用标准的哺乳动物组织培养箱，可将其置于低温房间并加热至23°C，或放置于实验室中，关闭温度控制，于培养箱底部托盘内放置冰块以将温度调节至接近室温。
   

IX. 喂养细胞

1. 第1天（次日），加入0.5 ml CNBM/B27（条件培养基），配制成3:1 DDM2:CNBM/B27的培养基。
2. 第5天，更换1 ml培养基为3:1 DDM2:CNBM/B27。
3. 每隔4–5天以3:1 DDM2:CNBM/B27继续喂养细胞。
   
   注意：培养物可在无非神经元条件培养基的条件下生长，但神经元会显得较为脆弱，在进行电生理实验时更难操作。

讨论

从胚胎期或出生后啮齿类动物脑组织中分离的神经元可在原代细胞培养体系中生长，其可延伸出神经突并形成具有功能的突触连接。此类培养方法已较为成熟，且啮齿类神经元培养研究在鉴定参与突触形成与功能调控的基因及环境因素方面发挥了关键作用（Banker 和 Goslin，1991）。尽管多种昆虫的神经元也可在体外培养，但迄今仅发现果蝇（Drosophila）神经元可在培养中形成具有功能的突触连接（Rohrbough 等，2003）。在确定培养基中培养的原肠中期果蝇胚胎来源的神经母细胞可分化为具有电兴奋性的神经元，并形成功能性神经元间突触连接（O'Dowd，1995；Lee 和 O'Dowd，1999）。为了鉴定那些已知参与介导成年个体行为的神经元中调控突触形态与功能的因素，我们开发了本视频所展示的技术，用于从晚期果蝇脑组织中分离并培养神经元（Su 和 O'Dowd，2003）。该方法的一个关键特征是使用木瓜蛋白酶（papain），而非传统昆虫神经元培养中常用的胶原酶或其他强效酶。木瓜蛋白酶处理后获得的离散神经元可保留较短的轴突结构，这些神经元能够存活、再生神经突，并形成功能性神经元间突触连接。对特定细胞群（包括蘑菇体Kenyon细胞）进行全细胞记录显...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Concanavalin A		Sigma-Aldrich	C-2010	向2.5 mL DS中加入25 mg刀豆蛋白A（Concanavalin A）瓶装试剂，配制成10 mg/mL浓度。分装为每份90 μL，于-20℃保存。 °C，不超过3个月。
层粘连蛋白		Sigma-Aldrich	L-2020	向1 mg 层粘连蛋白（Laminin）瓶中加入1 mL DS，配制成0.5 mg/mL浓度。分装成10份 μL，并在 -20 保存 °C，不超过3个月。
盖玻片		贝尔科玻璃	1943-00012	12 mm 玻璃盖玻片
ConA + 层粘连蛋白溶液				储备液（Con A 储备液与层粘连蛋白储备液），用于盖玻片包被：在 5 mL DS 中加入 83.5 μL of ConA (167 μg/mL）和 8.35 μuL 层粘连蛋白（0.835） μg/mL）。混合。分装成每份100 μL 并在 -20℃ 下保存 °C，不超过一个月。
解剖液	缓冲液			500 ml 配方：400 ml 超滤水 + 25 ml 储存液 A + 14 ml 储存液 B + 3.0 g (33.3 mM) D-(+)-葡萄糖 (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) 蔗糖 (Sigma S-0389)。用 1 N NaOH（约 2 ml）调节 pH 至 7.4。用超滤水定容至 500 ml。倒入洁净玻璃瓶中，高压灭菌。贴标签 "解剖液" 并在 4°C 下保存。
解剖液	缓冲液			500 ml 配方：400 ml 超滤水 + 25 ml 储存液 A + 14 ml 储存液 B + 3.0 g (33.3 mM) D-(+)-葡萄糖 (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) 蔗糖 (Sigma S-0389)。用 1 N NaOH (约 2 ml) 调节 pH 至 7.4。用超滤水定容至 500 ml。转移至洁净玻璃瓶中，高压灭菌。贴标签 "解剖液" 并在 4°C 下保存。
溶液B：HEPES	缓冲液	Sigma-Aldrich	H-3375	20.97克（9.9 mM）。加入超滤水至200毫升，搅拌至完全溶解，再定容至250毫升。置于洁净瓶中，高压灭菌。贴标签 "溶液B" 并在 4 °C 下保存。
溶液A	缓冲液			500 ml 配方：80.0 g（137 mM）NaCl（Sigma S-9625）、4.0 g（5.4 mM）KCl（Sigma P-4504）、0.24 g（0.17 mM）Na2HPO4（Sigma S-0876）、0.3 g（0.22 mM）KH2PO4（Sigma P-5379）。称取所有组分，加入 400 ml 超滤水搅拌至完全溶解，加水定容至 500 ml。转移至洁净容器中，高压灭菌。贴标签 "溶液A" 并在4℃保存°C.
包被盖玻片：将经高压灭菌的盖玻片放入60 mm培养皿中。用移液器将5 μl的Con A/层粘连蛋白混合液滴加至每张盖玻片中央。置于37°C培养箱中孵育2小时。每次用100 μl高压灭菌水对盖玻片进行冲洗，共冲洗3次，使用连接真空泵的无菌巴斯德吸管进行操作。在最后一次冲洗时，用镊子夹起盖玻片并干燥两面。将盖玻片转移至35 mm培养皿中。室温保存，最长可保存一个月。