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1. 动物灌注
- 灌注前一天，准备以下溶液：
- 2 L 磷酸盐缓冲液（PB；100 mM，pH 7.4）和 1 L 磷酸钠缓冲盐水（PBS；含 0.9% NaCl 的 50 mM PB，pH 7.4），均使用双蒸水配制。将 PBS 和 1 L PB 储存于 4°C，用于后续灌注及包埋前免疫细胞化学处理。
- 1 L 4.0% 多聚甲醛（PFA，pH 7.4）固定液，可满足 6 只小鼠的灌注需求。配制时，在通风橱中加热 1 L PB 至 60°C，称取 40 g 颗粒状多聚甲醛（PFA）加入 PB 溶液中。待溶液澄清且 PFA 完全溶解后，冷却至室温（RT），并于 4°C 保存。
- 灌注当天，在通风橱中配制 500 mL 3.5% 丙烯醛溶液（溶于 PB）。随后，使用滤纸过滤 3.5% 丙烯醛溶液和 4.0% PFA 溶液。
- 对小鼠进行麻醉时，使用 27 号 ½" 针头向腹腔注射戊巴比妥钠（80 mg/kg）。
- 灌注过程中，依次向小鼠循环系统灌入 50 mL PBS、75 mL 丙烯醛和 150 mL PFA。为设置蠕动泵，先用 PBS 填充管道，并在一端安装 23 号 ¾" 蝶形针头。将管道另一端浸入灌注液（PBS、丙烯醛或 PFA）中。设定蠕动泵流速为 20–25 mL/min（适用于幼年及成年小鼠）。整个灌注过程中，需仔细避免管道内产生气泡。
- 待麻醉小鼠对疼痛刺激（如尾部夹捏）无反应后，方可继续操作。将动物置于解剖托盘中，用胶带固定四肢。使用镊子和剪刀切开皮肤及胸腔以暴露心脏。为尽量减少脑缺血，应迅速开始灌注。用小剪刀剪开右心房，启动蠕动泵。用镊子夹住心脏，将蝶形针头插入左心室心尖部位。
- 更换灌注液时，先停止蠕动泵，将管道从一种溶液转移至另一种溶液，然后立即重新启动泵。
- 当 150 mL PFA 灌注完成后，停止蠕动泵。用小剪刀剪下头部，切开皮肤，并在两眼之间敲开颅骨。使用小镊子小心剔除颅骨碎片，直至脑组织可被轻松取出。将脑组织在 4°C 的 PFA 中后固定 2 小时，随后用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
- 立即在冰浴 PBS 中使用振动切片机将脑组织切成横断面切片（厚度 50 μm）。用细毛刷将用于免疫细胞化学染色的切片转移至含 PBS 的玻璃小瓶中。其余切片可储存在含防冻剂（PBS 中含 30% 乙二醇和 30% 甘油）的溶液中，置于 -20°C，可保存数年。
2. 包埋前免疫细胞化学
- 进行免疫细胞化学染色时，切片应在玻璃小瓶中以游离漂浮的方式处理。整个操作过程中需小心避免切片干燥。
- 首先用移液管吸除 PBS，立即加入含有 0.1% 硼氢化钠的 PBS 新鲜溶液，在室温下孵育 30 分钟。
- 用 PBS 漂洗切片 3 次，每次 10 分钟，彻底去除气泡，并在含有 0.5% 明胶和 5% 与二抗同源动物的正常血清（在本例 Iba1 免疫染色中为正常山羊血清）的 PBS 封闭液中，于室温孵育 2 小时。
- 在封闭液中加入一抗，孵育 48 小时。对于 Iba1 免疫染色，使用兔抗 Iba1 抗体（1:1000）。
- 用 PBS 漂洗切片 3 次，每次 10 分钟，然后在封闭液中加入与生物素偶联的二抗（1:1000），于室温孵育 2 小时。
对于 Iba1 免疫染色，使用山羊抗兔 IgG。
- 用 PBS 漂洗切片 3 次，每次 10 分钟，然后在封闭液中加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶（1:1000），于室温孵育 1 小时。
- 用 PBS 漂洗切片 10 分钟，再用 Tris/HCl 缓冲盐水（TBS；50 mM，pH 7.4）漂洗 2 次，每次 10 分钟。为显色，将切片置于含 0.05% DAB 和 0.01% 过氧化氢的 TBS 溶液中（现配现用）。当染色呈现深棕色时（见图 1 示例），用 TBS 漂洗终止反应。无论如何，反应时间最长不得超过 5 分钟。随后用 TBS 漂洗 10 分钟，再用 PB 漂洗 2 次，每次 10 分钟。
3. 透射电子显微镜样品制备
- 使用细毛刷将切片转移至多孔培养板中的磷酸盐缓冲液（PB）中。在通风橱内配制1%四氧化锇溶液。吸除培养板各孔中的PB，并用细毛刷将切片展平。立即将切片浸入1%四氧化锇溶液中，在室温下固定30分钟。
- 将切片转移至玻璃小瓶中，用PB漂洗3次，每次10分钟；随后通过逐步提高浓度的乙醇进行脱水处理：35%乙醇浸洗2次，每种50%、70%、80%、90%和95%乙醇各1次，100%乙醇浸洗3次，最后用丙烯酸甲酯浸洗3次。
- 配制Durcupan树脂时，将20 g组分A、20 g组分B、0.6 g组分C和0.4 g组分D加入一次性烧杯中，充分混合至颜色均匀，然后倒入铝制称量皿中。如有需要，可将树脂倒入包埋模具中，在55°C烘箱中固化48–72小时，制成树脂块。
- 使用经丙烯酸甲酯冲洗过的细毛刷，将切片从丙烯酸甲酯中取出，并浸入Durcupan树脂中，在室温下浸渍过夜以完成渗透。
- 次日，将铝制称量皿放入55°C烘箱中加热10分钟以软化树脂。用经丙烯酸甲酯冲洗过的毛刷，在ACLAR包埋膜上涂布一层薄树脂，将切片平铺其上，再覆盖另一层包埋膜，并在上方均匀放置轻质重物（约2 g，例如玻璃小瓶的塑料盖），以促进树脂均匀分布。将样品置于烘箱中于55°C孵育48–72小时，完成树脂聚合。
- 聚合完成后，移除切片上方的重物和包埋膜。在双目解剖显微镜下，选取感兴趣的方形区域（约2×2 mm），并用剃刀刀片小心地从膜上切割下来。
- 使用瞬干胶（Superglue）将感兴趣区域粘附于树脂块顶端，并在55°C烘箱中固化1小时。
- 为切片做准备，用剃刀刀片将树脂块修整成等腰梯形。
- 使用超薄切片机和玻璃刀，去除组织表面的胶水和树脂。在玻璃刀的槽中加入重蒸水，切取数片半薄切片（厚度为0.5–1 μm）。
- 用完美环将切片转移至SuperFrost载玻片上。将载玻片置于80°C加热板上干燥1分钟。滴加数滴0.1%甲苯胺蓝染液（2 g硼砂和0.2 g甲苯胺蓝溶于200 mL重蒸水中），染色1分钟。用重蒸水冲洗去除多余染液。在光学显微镜下观察切片，可清晰区分染色的组织与树脂（图2）。
- 继续切片，直至组织与树脂的边界位于切片中央。请注意，以下操作需要经过训练。将玻璃刀更换为钻石刀，并在刀槽中加入重蒸水。切取银色至银金色的超薄切片（厚度为60–80 nm），使用精细倒置镊子小心收集于铜网载网上。将载网置于滤纸上干燥。
- 为增强反差，可用柠檬酸铅染色超薄切片（0.03 g柠檬酸铅和0.1 mL 10N氢氧化钠溶于10 mL重蒸水中1）。用精细倒置镊子将载网置于一滴柠檬酸铅溶液上，染色2分钟。取出载网，依次在3份重蒸水中轻轻漂洗。最后将载网置于滤纸上干燥，并存放于载网盒中，待进行透射电子显微镜观察（图3–6）。
4. 代表性结果
图1. 光学显微镜下Iba1染色切片。Iba1的细胞分布仅限于小胶质细胞，表明免疫染色具有特异性。比例尺=100 μm。
图2. 光学显微镜下的甲苯胺蓝染色半薄切片。请注意组织与树脂之间的边界，该处在电子显微镜下免疫染色将显示最强信号。
图3. 透射电镜下显示Iba1免疫阳性的小胶质细胞胞体及其突起的超薄切片。Iba1阳性的结构成分可通过其免疫过氧化物酶-DAB电子致密沉淀物进行识别。比例尺=2 μm。
图4. 电子显微镜下显示不同大小和形状的Iba1免疫阳性小胶质细胞突起的超薄切片。比例尺=2 μm。
图5. 超薄切片在更高放大倍数下显示图4中Iba1阳性的小胶质细胞突起，可识别其细胞内细胞器。比例尺=1 μm。
图6. 超薄切片在更高放大倍数下显示Iba1阳性小胶质细胞突起与包括突触在内的邻近神经组织成分之间的超微结构关系。比例尺=1μm。