小鼠脑组织免疫电子显微镜样品制备

摘要

我们描述了一种小鼠经心脏灌注、脑组织的取出与切片，以及免疫过氧化物酶染色、树脂包埋和脑切片超薄切片的实验方案。完成这些步骤后，免疫染色的样品即可用于透射电子显微镜观察。

摘要

透射电子显微镜（TEM）在高空间分辨率下对中枢神经系统中小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的亚细胞结构（如树突、树突棘、轴突、轴突终末、胞体）及其细胞内细胞器和细胞骨架进行可视化观察具有极高价值。结合TEM与包埋前免疫细胞化学技术，可有效区分形态特征不明显的细胞成分，并提供识别依据（例如，使用针对小胶质细胞特异性标志物Iba1（离子化钙结合接头分子1；本文所示）的抗体来识别小胶质细胞胞体及突起），还可用于鉴定细胞成分中的神经递质内容（如5-羟色胺能）以及可溶性或膜结合蛋白的超微结构定位（如5-HT1A和EphA4受体）。本文介绍了一种小鼠经心脏灌注丙烯醛固定剂、脑组织取出与切片，以及免疫过氧化物酶-二氨基联苯胺（DAB）染色、树脂包埋和脑组织切片超薄切片的实验方案。完成上述步骤后，免疫染色样本即可用于TEM观察。若严格操作，该技术可在优异的超微结构保存与免疫细胞化学检测之间实现良好平衡。 关键词：透射电子显微镜，TEM，免疫细胞化学，包埋前染色，DAB染色，树脂包埋，超薄切片，小胶质细胞，Iba1，5-HT1A受体，EphA4受体，中枢神经系统，小鼠

方案

1. 动物灌注

1. 灌注前一天，准备以下溶液：
   - 2 L 磷酸盐缓冲液（PB；100 mM，pH 7.4）和 1 L 磷酸钠缓冲盐水（PBS；含 0.9% NaCl 的 50 mM PB，pH 7.4），均使用双蒸水配制。将 PBS 和 1 L PB 储存于 4°C，用于后续灌注及包埋前免疫细胞化学处理。
   - 1 L 4.0% 多聚甲醛（PFA，pH 7.4）固定液，可满足 6 只小鼠的灌注需求。配制时，在通风橱中加热 1 L PB 至 60°C，称取 40 g 颗粒状多聚甲醛（PFA）加入 PB 溶液中。待溶液澄清且 PFA 完全溶解后，冷却至室温（RT），并于 4°C 保存。
2. 灌注当天，在通风橱中配制 500 mL 3.5% 丙烯醛溶液（溶于 PB）。随后，使用滤纸过滤 3.5% 丙烯醛溶液和 4.0% PFA 溶液。
3. 对小鼠进行麻醉时，使用 27 号 ½" 针头向腹腔注射戊巴比妥钠（80 mg/kg）。
4. 灌注过程中，依次向小鼠循环系统灌入 50 mL PBS、75 mL 丙烯醛和 150 mL PFA。为设置蠕动泵，先用 PBS 填充管道，并在一端安装 23 号 ¾" 蝶形针头。将管道另一端浸入灌注液（PBS、丙烯醛或 PFA）中。设定蠕动泵流速为 20–25 mL/min（适用于幼年及成年小鼠）。整个灌注过程中，需仔细避免管道内产生气泡。

讨论

本文介绍了一种用于免疫电子显微镜的小鼠脑组织制备方案，若严格操作，该方法可在超微结构良好保存与免疫细胞化学检测之间实现最佳平衡。

结合透射电镜（TEM），该方法能够区分缺乏明显特征和鉴定标准的细胞结构。特别是，Iba1 的免疫过氧化物酶-DAB 染色可识别神经组织中微胶质细胞的胞体和突起，并可用于分析其形态学特征、细胞内细胞器以及与其他细胞成分的超微结构关系（图3-6）。此外，本方案可用于分析可溶性或膜结合蛋白在胶质细胞或神经元结构中的超微结构定位，以及这些蛋白与细胞内细胞器的关联情况。事实上，通过本方案结合特异性抗体，我们先前已揭示了5-HT1A和5-HT1B5-羟色胺受体在成年大鼠中缝背核、黑质、苍白球和海马组织中的神经元胞体、树突、树突棘、无髓鞘轴突及内皮细胞中的超微结构定位²。我们还报道了EphA4和EphB2酪氨酸激酶受体在小鼠和大鼠出生后发育期及成年期的海马和大脑皮层中，定位于网格蛋白包被小泡以及不同类型的星形胶质细胞和神经元结构中的超微结构分布^3,4,5,6。最后，该方案还可与预包埋免疫胶体金技术联合使用，以分析两种同时标.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
戊巴比妥钠（Nembutal）	OVATION Pharmaceuticals
滤纸 315 24 cm	VWR international	28331-081
*丙烯醛 纯品（≥95%）	Sigma-Aldrich	01680
硼氢化钠（≥98%）	Sigma-Aldrich	452173
*颗粒状多聚甲醛（PFA）（95%）	Sigma-Aldrich	441244
正常山羊血清	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
兔抗Iba1一抗	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	019-19741	储存于 -20°C，以1:1甘油保存
生物素-SP标记的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗兔IgG（针对Fc片段）	Jackson ImmunoResearch	111-066-046	储存于 -20°C，以1:1甘油保存
辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素	Jackson ImmunoResearch	016-030-084	储存于 -20°C，以1:1甘油保存
*四氧化锇 4% 溶液	Electron Microscopy Sciences	19150	避光保存
环氧丙烷（≥99%）	Sigma-Aldrich	82325
聚丙烯一次性烧杯（50 mL）	Fisher Scientific	01-291-10
铝制称量皿（70 mm）	Fisher Scientific	NC9261784
Durcupan环氧树脂	Electron Microscopy Sciences	14040
包埋模具	Electron Microscopy Sciences	70907
组织学用DPX封片剂	Sigma-Aldrich	44581
明胶处理载玻片	VWR international	100241-864
ACLAR包埋膜（7.8 mm）	Electron Microscopy Sciences	50425
胶囊模具	Electron Microscopy Sciences	70150
高性能超级胶水	Corporate Express	LOC30379
超薄切片用完美捞片环	Electron Microscopy Sciences	70944
Superfrost载玻片	Fisher Scientific	22-178-277
金刚石切片刀 超薄型 45°（2.5-3.5 mm）	Diatome
冷水鱼皮明胶（~45%）	Sigma-Aldrich	G7765
*操作丙烯醛、多聚甲醛和四氧化锇时，必须始终在通风橱中进行，并佩戴腈手套，同时应妥善处理废弃物。