in vivo 条件下比较非洲爪蟾 Xenopus laevis 中 gp96 佐剂活性的研究

摘要

青蛙 非洲爪蟾 为研究热休克蛋白（如 gp96）促进抗原特异性 CD8 T 细胞反应的能力，提供了一种具有吸引力的非哺乳动物替代模型。我们介绍了相关研究方法 体内 gp96促进皮肤和肿瘤抗原的交叉提呈

摘要

我们已在两栖动物中开发出 非洲爪蟾 一种独特的非哺乳动物模型，用于研究某些热休克蛋白（如 gp96）促进伴载抗原交叉提呈并诱导天然免疫和适应性T细胞反应的能力。 非洲爪蟾 皮肤移植排斥为研究gp96诱导经典MHC Ia类（class Ia）限制性T细胞反应的能力提供了一个极佳的平台。此外，该 非洲爪蟾 该模型系统也为研究gp96在诱导针对已下调其Ia类分子从而逃避免疫监视的肿瘤的免疫应答能力方面，提供了小鼠之外的一种理想替代方案。近期，我们建立了一种过继性细胞转移检测方法 非洲爪蟾 使用腹腔白细胞作为抗原呈递细胞（APCs）筛选克隆，并证实gp96能够启动CD8 T细胞应答 体内 针对次要组织相容性皮肤抗原以及对 非洲爪蟾 胸腺肿瘤15/0不表达Ia类分子。本文描述了进行这些实验所需的方法，包括腹腔白细胞的诱导、负载抗原、过继性转移，以及皮肤移植和肿瘤移植实验。此外，还介绍了外周血白细胞的采集与分离方法，用于流式细胞术和增殖实验，以进一步表征参与皮肤排斥和抗肿瘤免疫反应的效应细胞群体。

方案

1. 动物

X. laevis 与 X. gilli 的杂交后代 LG-6 和 LG-15 同源克隆¹来自罗切斯特大学的繁殖种群（http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm）。LG-6 和 LG-15 具有相同的杂合 MHC 单倍型（a/c），但在次要组织相容性（H）位点上存在差异。这些克隆的后代通过雌核发育方式产生，即雌性产生的二倍体卵子由经紫外线照射的精子激活（精子不向后代提供 DNA）。

戴手套是可选的。有些人更倾向于不戴手套，因为戴手套会使操作青蛙（滑溜）变得更加困难，而且实际上似乎会让青蛙感到不适。

2. 从15/0肿瘤（同时表达肿瘤抗原和次要H-Ag）中纯化gp96

Gp96 的纯化方法已有先前报道^{2, 3}。简言之，Gp96 通过 50-70% 硫酸铵分级沉淀，随后经 ConA-Sepharose 和 DEAE 层析进行纯化。每 1 mL 肿瘤组织可获得约 20-50 μg 蛋白质。纯化产物的纯度通过 SDS-PAGE 及银染法测定。

3. 从主要组织相容性抗原差异的 LG-6 蛙中诱导和采集腹腔白细胞（PLs）

1. 培养25 mL过夜培养物 大肠杆菌 在37°C条件下，于50 mL锥形管中振荡培养。
2. 第二天，通过煮沸1小时使细菌热灭活。
3. 离心热灭活的样品 大肠杆菌 在4°C、2,000 rpm（1,500 g）条件下离心15分钟。
4. 去除上清液，将细菌沉淀重悬于1/10体积的溶液中^th 在APBS中加入原始培养液体积（2.5 mL）。此时细菌培养物已准备好使用，须在24小时内使用完毕。
5. 使用25号5/8针头，每只青蛙腹腔注射（i.p.）200 μL（2英寸青蛙）或300 μL（3英寸青蛙）热灭活细菌制剂。
6. 注射后第3天，通过腹腔灌洗收集PLs。
7. 在采集PL之前，将成年青蛙浸入用碳酸氢钠缓冲的0.1%三卡因甲烷磺酸盐（TMS，MS-222）水溶液中进行麻醉，持续最多5分钟，直至所有活动停止（持续时间取决于个体的大小和年龄）。动物在处理后10–20分钟内苏醒。
8. 用少量70%乙醇对青蛙腹部进行消毒。
9. 使用18号1½英寸针头，向腹腔内注射5 mL（2英寸大小的蛙）或10 mL（3英寸大小的蛙）室温预热的无菌APBS。拔出针头后，轻轻按摩蛙体1分钟，以确保注入的缓冲液与体腔内的液体充分平衡。
10. 使用一支新的18号1½英寸无针筒针头，收集从针头后端滴出的腹腔液体，滴入洁净的50 mL圆锥形离心管中。应尽量回收最初注入的全部液体体积。注意避免穿刺到腹部中央区域的血管。
11. 一旦收获完PLs，将青蛙放入盛有浅水的容器中，待其苏醒后即可放回笼中。

4. 将 Lg-6 Pls 脉冲后过继转移至 naive Lg-6 受体

1. 用预冷的APBS洗涤PLs一次，在4°C下以1,000 rpm（750 g）离心10分钟。
2. 弃去上清液，将PLs重悬于APBS中。
3. 以每5 × 10⁵个PLs加入1 μg gp96的浓度，用gp96脉冲处理PLs。
4. 向PLs中加入适量gp96后，用移液器吹打混匀，并在冰上孵育1小时。
5. 将细胞在4°C下以1,000 rpm离心10分钟，或以14,000 rpm离心1分钟，以去除未结合的gp96。
6. 用预冷的APBS洗涤PLs三次，确保无残留的gp96。
7. 将经脉冲处理的PLs重悬至浓度为每300 μL含5 × 10⁵个PLs。
8. 采用腹腔注射方式过继性转移PLs，使用25号5/8针头，每只动物注射300 μL脉冲处理的PLs（含5 × 10⁵个细胞）。
9. 在进行皮肤移植或肿瘤攻击实验前，青蛙至少需要提前3天进行致敏处理。

5. 皮肤移植实验

皮肤移植排斥是一种成熟的检测方法，在 非洲爪蟾 ^{4, 5, 6}在 非洲爪蟾，当供体与受体之间存在1或2个MHC单倍型不匹配时，受体在21-22°C条件下于18-22天内会排斥供体皮肤。相比之下，仅在次要组织相容性抗原（minor H-Ags）上存在差异的LG-6与LG-15克隆之间的皮肤移植排斥发生得更缓慢（超过30天）。然而，若受体曾通过先前的皮肤移植或接种从供体纯化的gp96蛋白而被致敏，则对该供体次要H-Ag的排斥反应会加速。当供体与受体在遗传上完全相同时（例如克隆个体或完全近交系动物），则完全不发生排斥反应。因此，这一简单技术在表征免疫排斥机制方面具有很强的实用性 体内 由gp96诱导的免疫反应

1. 按照3.7节所述方法麻醉供体青蛙。
   注意：Xenopus 的皮肤可产生强效的抗菌肽（例如，magainin），因此无需采取完全无菌的操作程序，仅需采取最基本的预防措施即可。事实上，使用任何消毒剂处理青蛙都会对其皮肤造成损害。此外，Xenopus 不携带可传播给人类的病原体。因此，是否佩戴手套为可选操作。然而，所有使用的解剖器械均需经过高压灭菌，所有溶液必须为无菌状态。
2. 使用剪刀从LG-15型供体青蛙身上剪取一小块腹侧皮肤（即腹部皮肤，因含有虹彩细胞而呈银白色），大小约为20 mm × 5 mm。
3. 将皮肤置于含有APBS的培养皿中，并置于冰上保存。操作皮肤组织时应极为轻柔，避免使用镊子夹持。
4. 使用剃刀或剪刀将皮肤切成5 mm × 5 mm大小的单个移植物。将组织碎片置于含APBS的冰上保存。
5. 此时，将供体青蛙放入盛有浅水的容器中，待其苏醒后转移至含有抗生素（青霉素-链霉素，浓度为5 mg/L）的水中。青蛙需在含抗生素的水中饲养两天，之后再移回正常水中。皮肤取材部位的小型伤口无需缝合，可在一周内自然愈合。
6. 麻醉受体LG-6型青蛙。
7. 在受体动物背部（ dorsal ）皮肤上做一个小切口，将5 mm × 5 mm的移植物植入皮下，确保银白色面向上。注意避免在皮下引入大量气泡，否则可能导致移植物移位甚至脱落。
8. 务必记录移植物上由剪刀或镊子造成的标记，因为在开始评分时，这些区域不计入移植物排斥反应。
9. 24小时后，需去除覆盖在移植物上方的部分宿主皮肤。
10. 再次麻醉受体LG-6型青蛙。操作方式参照5.1节描述。
11. 使用高压灭菌的剪刀在移植物周围剪出一个观察窗，以便直接观察移植物。操作时注意不要触碰供体皮肤或引起出血。随后按照5.5节所述方法让青蛙恢复。
12. 立即开始对移植物进行评分，并绘制草图记录。皮肤移植物排斥程度根据移植物皮肤上虹彩细胞被破坏的百分比来判定。
13. 应每隔2至3天检查一次移植物，但此过程无需麻醉动物。为观察移植物，需将青蛙置于培养皿中，在体视显微镜下进行检查。

6. 移植皮肤的全组织免疫组织化学

青蛙整体免疫组织化学技术已有先前描述⁶。简而言之，将青蛙麻醉后置于显微镜下，其下方垫有经蛙用水预先润湿的无菌纸巾（操作区域也需无菌处理）。随后，将移植的皮肤连同少量周围宿主皮肤一并取下，并使用抗体进行染色，染色方法类似于用于流式细胞术分析的细胞染色⁶。操作过程中需使用经高压灭菌的器械和无菌缓冲液。染色完成后，将皮肤置于显微镜载玻片上，轻轻加盖盖玻片压平。此时，可利用荧光显微镜观察已浸润移植物的不同细胞群体。操作结束后，青蛙按第5.5节所述置于含抗生素的水中饲养，之后再转移至正常水中。皮肤取材后留下的小伤口可在一周内愈合。

7. 白细胞的表征

1. 在从青蛙体内采集血液之前，需通过在火焰上拉制无菌巴斯德移液管来制备“玻璃针”。在体视显微镜下将移液管的尖端进一步 sharpen（锐化）。然后将移液管连接至一根吸液用的塑料管。
   所有器械，如镊子和剪刀，在使用前均需进行高压灭菌。
2. 另取10 mL预冷的APBS，加入肝素至终浓度为每1 mL APBS中含50单位肝素，配制冰上保存的APBS+肝素溶液。所有使用的溶液均须无菌。
3. 按照3.7节所述方法对青蛙实施麻醉，并遵循5.1节所述的动物操作规程。
4. 切开后肢足部上方的皮肤，暴露跗背静脉。
5. 用1–2 mL APBS+肝素溶液填充巴斯德移液管。
6. 将“玻璃针”插入静脉，通过口吸缓慢开始采集血液。务必确保“玻璃针”内含有APBS+肝素溶液，以防止血液凝固并堵塞针尖。
7. 一只中等体型的青蛙可采集1至2 mL血液。
8. 青蛙腿部的小切口无需缝合，伤口将在一周内自行愈合。
9. 在4°C条件下，以1,000 rpm离心血液10分钟。
10. 弃去上清液，用10 mL冷APBS洗涤细胞一次。
11. 将2 mL血液（含1–5 × 10⁶个细胞）小心铺加到1 mL已室温预热的Ficoll Histopaque 1.077（Sigma）之上，以分离白细胞与红细胞。
12. 室温下以1,000 rpm离心20分钟，不启用刹车，随后收集白细胞层。
13. 用APBS洗涤细胞两次，每次在4°C下以1,400 rpm离心10分钟，以去除残留的Ficoll。
14. 此时细胞已准备好用于抗体染色以进行流式细胞术分析，或用于in vitro体外培养实验。

8. 肿瘤移植实验

1. 实验前约一周，解冻一批新鲜的15/0肿瘤细胞，并确保细胞开始良好生长。培养基的简要描述见下一节，详细信息见文献³。
2. 扩增15/0肿瘤细胞。
3. 实验当天，计数细胞并用台盼蓝排斥法测定细胞死亡率，细胞死亡率应低于5%。用冷的APBS洗涤细胞一次，在4°C下以1,000 rpm离心10分钟。
4. 将细胞重悬于肿瘤培养基中，浓度为每300 μL含5 × 10⁵个15/0细胞。
5. 通过皮下注射，使用25号5/8针头，每只蛙单侧背部（背侧）注射300 μL体积，含5 × 10⁵个细胞。
6. 肿瘤攻击后2–3周内将开始出现肿瘤生长。需记录肿瘤首次出现的时间，并每2–3天记录一次肿瘤体积。使用游标卡尺测量肿瘤体积（高度 × 长度 × 宽度）。
7. 一旦肿瘤生长至3,500 mm³或蛙出现精神萎靡状态，应实施安乐死以防止其不适。

9. 所需试剂：

• 两栖类磷酸盐缓冲液（APBS）：6.6 g/L NaCl，1.15 g/L Na₂HPO₄，0.2 g/L KH₂用10 N NaOH将pH调至7.5，并通过0.2 μm滤器过滤除菌。
• 三卡因甲烷磺酸盐（TMS，MS-222）（Crescent Research Chemicals，CAS号：886-86-2）
• 碳酸氢钠（Fisher Scientific S-233-500）。
• Histopaque-1077（Sigma-Aldrich 10771-100 mL）
• 肝素钠盐（Sigma-Aldrich H3149-50KU）
• 培养基 非洲爪蟾 15/0 肿瘤 [详见 3]：1 L Iscove DMEM 基础培养基（Gibco-Invitrogen 11965），添加 10 mL 胰岛素、10 mL 非必需氨基酸、10 mL 青霉素-链霉素、10 μg/mL 卡那霉素、3 mL primatone（Sheffield Products Division）、1 mL β2-巯基乙醇和 3.02 g NaHCO₃₃ 在水（pH 7.0）中。通过加入30%双蒸水将该培养基稀释至两栖类渗透压，并添加5%胎牛血清和20%上清液 非洲爪蟾 肾细胞系A6，以及0.25%的正常 非洲爪蟾 血清

10. 代表性结果

图1. 移植后第12天皮肤移植物排斥反应的体视显微镜分析。LG-6克隆蛙接受了来自（A）MHC相同的LG-6个体（无排斥反应）或（B）MHC不同的远交系供体（80%发生排斥）的皮肤移植物。箭头所示为银色的虹彩细胞（iridophore），标记健康的（未被排斥的）移植物组织。(*) 标记为镊子所致损伤，非排斥反应引起。

图 2. Gp96 促进 Xenopus 中肿瘤抗原的交叉提呈。 LG-15 PLs（5 × 10⁵）在冰上分别用 APBS（阴性对照）、来自 E. Coli 培养物的 1 μg 重组纯化 gp96，或来自 15/0 肿瘤组织的 1 μg 或 0.5 μg 纯化 gp96 脉冲处理 1 小时。经过 3 次洗涤后，将细胞过继转移至 LG-15 成年受体（每只 1 × 10⁶）。三天后，通过皮下注射移植活的 15/0 肿瘤细胞（5 × 10⁵）。每条曲线代表一只青蛙体内肿瘤生长的动力学过程。监测攻击后肿瘤首次出现的天数，并定期使用游标卡尺（长度 × 宽度 × 厚度）测定肿瘤大小。

讨论

非洲爪蟾（Xenopus）是一种独特且用途广泛的非哺乳动物模型，可用于研究免疫学。其在生物医学和免疫学研究中的广泛应用，已催生出许多重要的研究工具，例如主要组织相容性复合体（MHC）定义的LG-6和LG-15克隆，以及多种细胞系和单克隆抗体。利用这些工具，我们已建立多种体外（in vitro）和体内（in vivo）检测方法，用于研究热休克蛋白（如gp96）介导强效抗原特异性抗次要组织相容性抗原（minor H-Ag）及抗肿瘤T细胞反应的能力⁷。该模型系统使我们能够进一步探究gp96在T细胞致敏和效应阶段的免疫学特性。

关于启动阶段，早期研究这些反应时采用的是皮下注射纯化的gp96，需在皮肤移植或肿瘤移植等体内检测前，每隔两周注射两次，每次10 μg gp96^{2, 8}。相比之下，我们所建立⁷并目前正在使用的交叉呈递方法更为简便高效。该启动策略具有多种优势，包括每个实验所需的时间和蛋白用量。例如，传统方法免疫一只动物需要4周时间和20 μg gp9...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>所需试剂：
两栖类磷酸盐缓冲液（APBS）：
NaCl，1.15 g/L
Na2HPO4，0.2 g/L
KH2PO
10 N NaOH
三卡因甲烷磺酸盐（TMS，MS-222）	Crescent Research Chemicals	CAS#886-86-2
碳酸氢钠	Fisher Scientific	S-233-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	100ml
肝素钠盐	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
非洲爪蟾15/0肿瘤培养基[详见参考文献3]：
Iscove DMEM 基础培养基	GIBCO，隶属于 Life Technologies	11965
胰岛素
非必需氨基酸
青霉素-链霉素
卡那霉素
Primatone	谢菲尔德产品部
β2-巯基–乙醇
NaHCO₃
30% 双蒸水
5% 胎牛血清
20% A6非洲爪蟾肾细胞系上清液
0.25% 正常非洲爪蟾血清
<强>材料与设备：
50 和 15 ml 锥形离心管（无菌）
25 号 5/8 英寸 Precision Glide 无菌针头	BD 生物科学
18号规格 1½ 精密滑动无菌针头	BD 生物科学
1 ml 结核菌素滑动针头注射器，无菌	BD 生物科学
10 ml 无菌滑动接头注射器	BD 生物科学
1.5 ml 微型离心管（无菌）
60 × 15 mm 聚苯乙烯无菌培养皿	Falcon BD
剃须刀片
25 X 75 mm X 1 mm 优质载玻片	Fisher Scientific
10 cm 玻璃培养皿
9" 巴斯德移液管 杜蕾斯 硼硅酸盐玻璃 棉塞 一次性	VWR 国际
Tygon 管路
两把5号瑞士钟表匠镊子’镊子	Miltex Inc.
麦氏-范纳斯微型解剖直剪，6毫米切割刃	Roboz外科器械公司
Helios 游标卡尺
解剖显微镜
高强度照明器
血细胞计数板
未使用本生灯
37°C 摇床培养箱
离心