DNA稳定同位素示踪（DNA-SIP）

摘要

DNA稳定同位素示踪是一种不依赖培养的方法，用于鉴定和表征能够利用特定底物的活性微生物群落。底物中富集的重同位素被微生物同化后，标记的原子被整合到微生物生物量中。通过密度梯度超速离心分离标记的DNA，用于后续分子分析。

摘要

DNA稳定同位素探针技术（DNA-SIP）是一种用于鉴定能够将特定碳源和营养物质同化为细胞生物量的活性微生物的强有力方法。因此，这种无需培养的技术已成为将代谢功能归因于广泛存在于各类陆地和水生环境中的复杂微生物群落的重要手段。在将环境样品与稳定同位素标记的化合物共同孵育后，提取的核酸需经过密度梯度超速离心及后续的梯度分段收集，以分离不同密度的核酸。通过从氯化铯中纯化DNA，可获得标记与未标记的DNA，用于后续分子表征分析（如指纹图谱、微阵列、克隆文库、宏基因组学等）。本JoVE视频实验方案以可视化方式逐步讲解密度梯度超速离心、梯度分段收集及标记DNA回收的完整操作流程。该方案还包括典型的SIP实验数据，并强调了确保DNA-SIP分析成功所必须注意的关键提示与注意事项。 关键词：DNA稳定同位素探针技术，DNA-SIP，密度梯度超速离心，梯度分段收集，标记DNA回收，分子表征，环境微生物学，代谢功能分析

方案

1. 试剂的准备

DNA-SIP 需要使用一些试剂，这些试剂应在实际操作前预先配制。本节列出了每种试剂的配制方法，这些方法改编自先前的SIP实验方案¹。

1. 用于制备SIP梯度的氯化铯（CsCl）溶液——将603.0 g CsCl逐步溶解于去离子蒸馏水（ddH₂O）中，定容至500 mL，配制成7.163 M的CsCl溶液。注意定容时不得超过500 mL！在搅拌过程中轻微加热有助于完全溶解CsCl。将最终溶液分装至密封容器中。在本实验室，常规储存方法是将100 mL溶液分装至125 mL血清瓶中，并用丁基橡胶塞压盖密封。密封后的溶液可在室温（20°C）长期保存。密封可防止溶液蒸发及CsCl“结壳”现象。通过称量三份100 μL的溶液，或使用经精确校准的数字折射仪（例如Reichert AR200）测定溶液密度。Reichert AR200在成功校准后，可在数年内保持稳定并提供准确读数。在室温（20°C）下，该溶液的密度通常为1.88–1.89 g ml^-1。每次新配制的储备液密度会略有差异。
2. 用于与溴化乙锭（EtBr）共同制备梯度的氯化铯溶液——将250 g CsCl与250 mL无菌ddH₂O水混合。按照1.1节所述方法，将该溶液分装至已用丁基橡胶密封垫压盖密封的血清瓶中。
3. 梯度缓冲液——将50 mL 1 M Tris-HCl、3.75 g KCl和1 mL 0.5 M EDTA加入400 mL水中，待KCl完全溶解后，用ddH₂O定容至500 mL。过滤除菌并高压灭菌。最终溶液含0.1 M Tris、0.1 M KCl和1 mM EDTA。
4. 聚乙二醇（PEG）溶液——将150 g聚乙二醇6000和46.8 g NaCl溶于无菌ddH₂O水中，定容至500 mL（30% PEG，1.6 M NaCl），高压灭菌。
   注意：该溶液在高压灭菌过程中会分相。在灭菌瓶中加入磁力搅拌子，以便在发生分相时充分混匀溶液。
5. TE缓冲液——使用高压灭菌的1 M Tris-HCl（pH 8.0）和0.5 M EDTA（pH 8.0）储备液，在无菌ddH₂O水中配制含10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和1 mM EDTA（pH 8.0）的溶液。过滤除菌并高压灭菌。
6. 70%乙醇——将350 mL高纯度乙醇与150 mL无菌ddH₂O水混合。

2. 样品孵育与DNA提取

在DNA-SIP孵育实验中，样品通常与稳定同位素碳（¹³C）标记的底物共同孵育。孵育时间及条件（如营养添加、湿度、光照）会因样品类型和底物性质的不同而有所差异。已成功使用多种单碳化合物^2,3、多碳化合物^4,5,6，以及氮标记^7,8或氧标记⁹的化合物开展DNA-SIP实验。然而，使用¹⁵N或¹⁸O标记化合物的一个缺点是标记核酸的物理分离效果较差，主要原因是DNA和RNA中氮和氧原子的数量相对于碳原子较少。

DNA-SIP 实验的一个关键对照是使用天然（例如 ¹²C）底物进行相同的培养。该对照可用于后续比较，以确保核酸的任何明显标记并非由超速离心过程或DNA的G+C含量密度差异导致的分离假象所致¹⁰。同时，保留冷冻样品材料以与“轻”和“重”DNA进行比较也十分重要，并建议设置无底物对照，以评估整个SIP培养过程中背景微生物群落的变化。

1. 在含有标记底物的微宇宙系统中孵育环境样品（图1）。根据我们的经验，对于土壤等高生物量样品，每克样品中掺入5-500 μmol的¹³C碳即可满足要求¹。对于生物量低于土壤的水体样品，每升样品中掺入1-100 μmol的¹³C碳可能产生可检测的重同位素信号¹。碳添加量、掺入生物量的碳比例以及同化过程中是否需要补充营养物质，均取决于待分析样品的特性及目标研究生物。不存在适用于所有样品的统一孵育条件。重要的是，SIP孵育所用底物浓度应尽可能接近其在自然环境（in situ）中的实际浓度；富集培养条件可能导致实验偏差¹⁰。
2. 在样品与稳定同位素标记底物共孵育后，采用严格的提取方法（用于PCR或小片段克隆）或可靠的酶解法（用于高分子量DNA克隆，例如大片段宏基因组学）从微宇宙系统中提取DNA。共提取的RNA通常不影响后续分析，因此也可使用同时获得RNA和DNA的提取方案。提取的DNA在超速离心过程中，片段长度短于约50 kb的不会发生剪切¹。
3. 在制备CsCl梯度超速离心管前，需对提取的DNA进行定量。若提取方法仅获得DNA（例如基于离心柱的试剂盒），可使用分光光度计（如Nanodrop 2000）进行定量；也可选择琼脂糖凝胶电泳法进行定量。

3. 准备超速离心用的梯度溶液

该实验步骤包括将DNA加入超速离心管中。由于存在多种类型的离心管和转子，具体操作流程会有所不同，需根据制造商的说明进行调整。尽管如此，我们建议使用垂直孔转子，以确保轻链和重链DNA实现最大程度的分离。我们采用贝克曼库尔特（Beckman-Coulter）Vti 65.2转子，配备16个孔，用于容纳5.1 ml QuickSeal聚烯烃管，本方案将提供在此条件下的具体操作步骤和注意事项。

1. 根据步骤 2.3 测定的 DNA 浓度，计算在超速离心管中提供 0.5 μg - 5 μg DNA 所需的提取 DNA 体积。
2. 在无菌一次性 15 ml 离心管中，将提取的 DNA（0.5 - 5 μg）与梯度缓冲液（见步骤 1.3）以及 4.8 ml 的 7.163 M CsCl 混合，总体积约为 6 ml。请注意，即使在相同摩尔浓度下，CsCl 溶液的密度也可能存在差异（见步骤 1.1）。可使用以下公式计算生成合适混合比例所需的梯度缓冲液与 DNA 溶液的体积：
   
   梯度缓冲液与 DNA 溶液体积（ml） = （CsCl 储备液密度 - 期望终密度）× 加入的 CsCl 储备液体积 × 1.52
   
   设定 CsCl 储备液体积为 4.80 ml，期望终密度为 1.725 g ml^-1。CsCl 储备液密度已在步骤 1.1 中测定。
   
   另请注意，CsCl 与梯度缓冲液/DNA 溶液的相对体积将导致总体积超过 5.1 ml。制备超过超速离心管最大容量（大于 5.1 ml）的体积，可确保有足够的溶液完全填满离心管。
3. 通过倒置混匀 10 次。DNA 在 CsCl 中于室温下稳定。

4. 制备溴化乙锭对照梯度（可选）

由于溴化乙锭（EtBr）是一种可插入DNA并形成复合物的染料，能在紫外光下使DNA可见，因此含有EtBr的对照梯度有助于在对样品管进行分馏前立即直观确认梯度的形成（例如图1）。在对照管中加入EtBr以及¹²C-DNA和¹³C-DNA（或¹⁴N-DNA和¹⁵N-DNA）的混合物，可在超速离心结束后立即观察到管内条带的形成。这一点非常重要，因为在超速离心中若发生试管破裂或运行程序设置不当，可能导致梯度形成失败。由于EtBr与DNA结合后会降低DNA的密度，因此制备此类梯度需采用不同的实验方案。请注意，可使用其他核酸染料替代EtBr¹¹，但使用其他荧光染料时需要对实验方案进行优化。

1. 对照梯度需要两种基因组DNA样品：一种用稳定同位素完全标记，另一种未标记。我们通常使用在以¹³C-或¹²C-葡萄糖为唯一碳源的培养基中培养的Sinorhizobium meliloti，或在含¹³C-或¹²C-甲烷条件下培养的Methylococcus capsulatus菌株Bath作为对照。
2. 取5–10 μg的¹²C-DNA和等量的¹³C-DNA，加入梯度缓冲液，于一次性15 ml螺口管中定容至1.00 ml。
3. 向同一管中加入1.00 g固体CsCl，通过倒置混匀。
4. 向步骤4.2中使用的同一螺口管中加入110 μl浓度为10 mg ml^-1的溴化乙锭（EtBr）溶液和4.3 ml浓度为1 g ml^-1的CsCl储备液。最终溶液的密度将接近原始CsCl储备液的密度。
5. 还需制备额外的含溴化乙锭的“空白”对照溶液，用于平衡步骤4.4中制备的溶液。在另一个15 ml螺口管中，混合1.00 mL梯度缓冲液、1.00 g CsCl、110 μl浓度为10 mg ml^-1的溴化乙锭溶液以及4.3 ml浓度为1 g ml^-1的CsCl储备液，通过倒置混匀。

5. 超速离心

1. 使用橡皮吸头和巴斯德移液管，小心地将步骤 3.2（或步骤 4.4，若制备 EtBr 对照梯度）中配制的梯度溶液加入超速离心管中。使用巴斯德移液管小心地将溶液加入离心管。用细的永久性记号笔在离心管肩部进行标记。注意：确保将离心管完全填充至管颈底部。填充不足的离心管在超速离心过程中可能发生破裂。
2. 当所有需要的离心管均装入样品溶液后，记录每根离心管的精确质量。将离心管配对并平衡至 0–10 mg 范围内。进行平衡时，先找出质量接近的配对，然后添加或移除微量溶液直至平衡，同时尽量使液面保持在管颈底部附近。注意：称量离心管时，我们使用一个倒置的、被切成两半的 15 ml 螺口离心管作为天平上的离心管支架。
3. 按照制造商说明书，使用“管帽”（tube topper）密封离心管。
4. 通过倒置离心管并施加适度压力，检查其密封是否良好。再次称量离心管，确认密封后仍保持在 0–10 mg 范围内的平衡状态。
5. 仔细检查每个转子孔，确保孔内清洁，无可能在超速离心过程中刺破离心管的碎屑或灰尘。
6. 将离心管插入转子中，保持配对平衡的离心管彼此相对放置。记录每个样品在转子中的位置，因为超速离心过程可能导致标记标签受损或擦除。按照制造商指示，小心密封转子孔。
7. 将转子装入超速离心机。关闭离心机门并抽真空。若使用 Vti 65.2 转子，设置转速为 44,100 rpm（约 177,000 × g_av），温度为 20°C，超速离心时间为 36–40 小时。选择抽真空、最大加速度，并关闭刹车功能（以确保减速过程不会破坏梯度）。注意：关闭刹车将使运行时间额外增加 1–2 小时。同时注意：较短的运行时间可能无法获得足够的条带分辨率。建议进行长时间超速离心，因其有助于提高不同核酸条带的分辨效果。
8. 超速离心程序一结束，立即小心取出转子。避免转子倾斜或碰撞，轻柔地从转子中取出离心管，以防扰动管内的梯度。在极少数情况下，离心管可能在运行过程中破裂。若发生此情况，其他离心管中的梯度可能未正常形成。如果包含了对照梯度，应在紫外光下仔细检查该管，确认梯度是否形成。若对照管中梯度未正常形成，建议重复整个第 5 步操作。注意：EtBr 对照管及其空白对照可在避光条件下保存，并在六个月内重复使用。在移除破裂的离心管后，应按照制造商说明书仔细清洁转子。切勿使用金属刷或研磨性清洁剂清洗转子孔，以免划伤转子孔！可从 Beckman 公司购买专用的转子清洁刷和清洁液。

6. 梯度分馏

目前有两种方法可用于从超速离心管中回收DNA：分段收集法和针头提取法。本方案仅描述使用分段收集技术提取DNA的过程。原因在于，在大多数稳定同位素探针（SIP）实验中，标记的DNA无法通过溴化乙锭（EtBr）显色观察，而必须通过比较多个样品管中相应的轻密度和重密度组分来检测。建议使用注射泵从超速离心管中收集等密度梯度的组分。我们使用BSP型号输注泵（Braintree Scientific Inc.）。也可采用低流速蠕动泵或高效液相色谱（HPLC）泵。

1. 用无菌ddH₂O充满一支无菌60 ml注射器，其中加入足量溴酚蓝染料以呈现深蓝色。将注射器放置在注射泵的加载臂上。连接装有23号1英寸针头的泵管，并启动泵，直至针头末端有部分ddH₂O流出。注意：此ddH₂O供应液中的任何气泡都会对分级分离过程产生负面影响。
2. 将一根超速离心管固定在夹具支架上。确保夹具夹紧程度适中，足以防止离心管移位，但又不至于因压力过大而在穿刺时导致CsCl溶液泄漏。使用新的23号1英寸针头，沿离心管接缝处穿刺管底最底部。为获得最佳效果，应以可控、迅速且果断的方式穿刺。此操作难度较高，建议在首次对样品管操作前反复练习多次。
3. 针对每个样品，准备12个无菌1.5 ml微量离心管，并标记样品编号及分级序号（1–12；从重到轻）。使用连接在泵管上的针头（步骤6.1），沿管壁接缝处穿刺离心管顶部的上肩部，用微量离心管收集梯度溶液。穿刺方式应与穿刺管底时一致，快速且可控。操作前应进行练习，并特别注意采用受控的抽拉动作，防止针头强行穿过离心管而刺伤手指！使用预先校准的泵速，使12分钟内收集到12 × 425 μl的组分（即425 μl min^-1）。
4. 使用数字折射仪（例如Reichert AR200；推荐）或分析天平检测一个梯度中各组分的密度，以确认梯度形成是否正常。本检测需使用约50 μl样品。我们通常在其中一个离心管中加入纯培养DNA（如制备EtBr对照梯度所述），作为分级分离的对照，并用于密度测定。预期密度范围约为1.690–1.760 g ml^-1，中位密度约为1.725 g ml^-1。

7. DNA 沉淀

1. 从所有组分中沉淀DNA，首先加入20 μg线性聚丙烯酰胺作为沉淀载体。通过倒置混匀。加入2倍体积的PEG溶液（见步骤1），并再次通过倒置混匀。注意：在从梯度组分中定量回收DNA时，使用沉淀载体（如糖原或线性聚丙烯酰胺）至关重要；但如果本方案中使用糖原作为沉淀载体，则需谨慎。已有研究表明，糖原制剂可能被细菌核酸污染，此类污染极易干扰SIP梯度组分结果的解读¹²。
2. 将离心管置于室温下静置2小时，以使DNA充分沉淀。如有需要，也可在室温下放置过夜。
3. 以13,000 g离心30分钟，离心时确保管底朝外，以保持转子中离心管方向的一致性。小心吸除并弃去上清液。此时应可见沉淀，但可能极难观察。建议在明亮光源下（例如台灯）操作，以便更清晰地观察沉淀。
4. 用500 μl 70%乙醇洗涤沉淀。以13,000 g离心10分钟。小心吸除并弃去上清液。此步骤中的沉淀通常更易观察，但也更容易从管壁脱落。
5. 将沉淀在室温下干燥15分钟。
6. 将每份沉淀重悬于50 μl TE缓冲液中（见步骤1.5）。按照标准实验室方案，取每份组分5 μl进行琼脂糖凝胶电泳分析。

8. 组分表征

用于表征密度梯度组分以评估SIP培养效果的方法将根据实验室条件和设备可用性而有所不同。针对16S rRNA基因采用指纹图谱法是一种常用方法，末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）或变性梯度凝胶电泳（DGGE）等技术均适用（图1）。按照上述方案操作，轻链DNA应出现在第9–11组分（约1.705–1.720 g ml^-1），而重链DNA指纹图谱应出现在第5–8组分（约1.720–1.735 g ml^-1）。在稳定同位素标记底物培养的样品中，若第5–8组分出现特异性指纹图谱，而在天然底物培养的对照样品中未出现，则为特定微生物参与特定标记底物代谢提供了有力证据。若某些应用（如杂交、宏基因组学）所需的标记DNA量不足，可采用多重置换扩增法以获得更大量的DNA^13-15，但该方法可能在扩增后的DNA中引入嵌合体^14,16。

9. 结果

典型的DNA-SIP结果将显示在超速离心形成的梯度中，标记的DNA与未标记的DNA发生分离。理想情况下，可完全分辨出高分子量的遗传物质（例如¹³C、¹⁵N标记的）与未标记物质。通过观察溴化乙锭（EtBr）对照管中的条带形成，可直观地判断分离效果。此外，还可利用各梯度组分中回收的基因组DNA浓度来确认梯度形成的正确性。

本实验方案中，我们展示了使用两种纯培养物的核酸进行梯度超速离心的代表性结果（图2）。该梯度分离样品是利用从S. meliloti（ATCC 1021）和¹³C标记的M. capsulatus str. Bath中提取的基因组DNA制备的。经过超速离心、梯度分馏和DNA回收后，标记与未标记的基因组DNA根据其密度差异分别分布于不同的梯度组分中（图2A）。重同位素标记的DNA出现在第4–5组分中，而未标记的DNA则在第9–10组分中浓度较高。对每个组分中的DNA进行变性梯度凝胶电泳分析¹⁷，PCR扩增产物显示出对应于梯度中两种微生物的清晰条带模式（图2B）。各组分的密度范围为~1.580 – 1.759 g ml^-1，图中从左至右按密度递减顺序排列。

尽管纯¹³C-和¹²C-DNA的分离效果可能较为明显（图2），但环境样品的孵育结果可能更难解释。例如，我们将加拿大努纳武特地区雷索卢特湾的冻原土壤样品分别与¹²C-或¹³C-标记的葡萄糖在15°C下孵育14天。纯化后的梯度组分DNA琼脂糖凝胶显示，无论是¹²C-还是¹³C-孵育样品，基因组DNA均在第7至10组分间呈“弥散”分布（分别为图3A和3C）。在此情况下，特定微生物类群生物量的¹³C富集程度只能通过如16S rRNA基因的变性梯度凝胶电泳（DGGE）等方法来确定。¹²C-葡萄糖孵育的土壤DNA在所有梯度组分中产生相似的DGGE图谱（图3B），而¹³C-葡萄糖孵育的样品则在第5至8组分中产生独特的DGGE指纹图谱（图3D）。尤其值得关注的是箭头所指示的保守条带。这一优势“系统型”在所有梯度组分中均一致存在，但在来自¹³C-葡萄糖孵育土壤的DNA中向较重组分发生偏移。对该条带进行后续的DNA测序和/或克隆文库分析，将可确认该特定16S rRNA基因的身份，并指导后续的宏基因组学或基于培养的研究策略。

图1. DNA-SIP 实验流程示意图，包括样品孵育、DNA 提取、CsCl 密度梯度超速离心以及利用分子技术对 DNA 进行表征。

图2. 包含两种纯培养物DNA的SIP梯度分馏预期结果。（A）取自梯度分馏1-12组分的DNA等分试样在1%琼脂糖凝胶上电泳，该梯度中含有¹³C标记的M. capsulatus Bath菌株（第4-6组分）和¹²C标记的S. meliloti（第8-10组分）。图中包含1-kb DNA分子量标准作为对照。（B）相同组分的PCR扩增DNA在10%变性梯度凝胶电泳（DGGE）凝胶上电泳。指纹图谱显示，例如第5组分与第9组分之间存在明显差异。

图3. 土壤样品培养后SIP梯度分馏的预期结果。¹²C-葡萄糖添加土壤（A）和¹³C-葡萄糖添加土壤（C）的梯度分馏等分试样在1%琼脂糖凝胶上电泳，并包含1-kb DNA标记物用于比较。各样品对应的DGGE指纹图谱分别显示于（B）和（D）。对分馏组分的指纹分析显示，在¹³C-葡萄糖添加样品的第5–8组分中特定细菌类群得到富集（D）。

讨论

稳定同位素探针（SIP）实验的合理设计对于获得高于背景未标记群落的标记DNA至关重要。有关样品孵育时间、底物浓度、孵育条件（如营养物、土壤含水量）、交叉喂养及重复设置等方面的考虑已在其他文献中讨论过^10,18，我们建议读者在设计SIP孵育实验时参考这些出版物。与本实验方案相关的是，还需特别关注SIP密度梯度数据分析中的一些额外注意事项。由于超速离心过程本身的特性，必须设置适当的对照，例如纯培养物和天然底物孵育的样品，以确保在特定组分中出现或消失的条带并非实验流程本身所导致的人为假象。例如，DNA在超速离心梯度中可能在琼脂糖凝胶上不可见（图2A），但仍可能污染整个梯度的所有组分（图2B）。尽管M. capsulatus的条带在图2B所示凝胶的高密度组分（5–7）中最明显，但在最轻的组分（12）中仍观察到了相同的DGGE图谱。通过周密设计的对照实验，可以对SIP梯度组分数据进行准确解读。

由于某些设计良好的SIP实验的特性（例如接近原位的底物浓度、较短的孵育时间），同位素掺入量可能非常低¹⁰。此外，与实验...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
溴酚蓝	试剂	费舍尔科技公司	BP115-25
氯化铯	试剂	费舍尔科技公司	BP210-500
乙醇，试剂级	试剂	西格玛-奥德里奇公司	652261
溴化乙锭	试剂	西格玛-奥德里奇公司	E1510
盐酸	试剂	费舍尔科技公司	351285212
线性聚丙烯酰胺	试剂	Applichem公司	A6587
聚乙二醇 6000	试剂	VWR国际公司	CAPX1286L-4
氯化钾	试剂	费舍尔科技公司	AC42409-0010
氯化钠	试剂	费舍尔科技公司	S2711
氢氧化钠颗粒	试剂	费舍尔科技公司	S3181
Tris碱	试剂	费舍尔科技公司	BP1521
暗读仪	设备	克莱尔化学公司	DR46B
微量离心机	设备	艾本德公司	5424 000.410
Nanodrop 2000	设备	费舍尔科技公司	361013650
输液泵	设备	布雷恩特里科学公司	N/A	型号：BSP 订购详情请见 www.braintreesci.com。
管路封口机	设备	贝克曼库尔特公司	358312
超速离心机	设备	贝克曼库尔特公司
超速离心机转子	设备	贝克曼库尔特公司	362754
紫外光源	设备	UVP公司	95-0017-09	任何紫外光源均可使用
紫外光防护面罩	设备	费舍尔科技公司	114051C
丁基橡胶塞，灰色	材料	西格玛-奥德里奇公司	27232
离心管	材料	贝克曼库尔特公司	342412
皮下注射针头，23号，2”长度	材料	BD生物科学公司	305145
微量离心管，1.5 mL	材料	DiaMed公司	AD151-N500
开放式中心密封圈，直径20 mm	材料	西格玛-奥德里奇公司	27230-U
巴斯德吸管，玻璃	材料	费舍尔科技公司	13-678-6C
移液器吸头	材料	DiaMed公司	BPS340-1000	目录号适用于200 μL吸头。10或20 μL吸头可从同一供应商处购买
泵用管路，内径1.5 mm × 壁厚1.5 mm	材料	Appleton Woods公司
螺口管，15 mL	材料	DiaMed公司	AD15MLP-S
血清瓶，125 mL容量	材料	西格玛-奥德里奇公司	Z114014
注射器，60 mL	材料	BD生物科学公司	309653