DNA稳定同位素示踪是一种不依赖培养的方法，用于鉴定和表征能够利用特定底物的活性微生物群落。底物中富集的重同位素被微生物同化后，标记的原子被整合到微生物生物量中。通过密度梯度超速离心分离标记的DNA，用于后续分子分析。
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摘要
摘要
DNA稳定同位素探针技术（DNA-SIP）是一种用于鉴定能够将特定碳源和营养物质同化为细胞生物量的活性微生物的强有力方法。因此，这种无需培养的技术已成为将代谢功能归因于广泛存在于各类陆地和水生环境中的复杂微生物群落的重要手段。在将环境样品与稳定同位素标记的化合物共同孵育后，提取的核酸需经过密度梯度超速离心及后续的梯度分段收集，以分离不同密度的核酸。通过从氯化铯中纯化DNA，可获得标记与未标记的DNA，用于后续分子表征分析（如指纹图谱、微阵列、克隆文库、宏基因组学等）。本JoVE视频实验方案以可视化方式逐步讲解密度梯度超速离心、梯度分段收集及标记DNA回收的完整操作流程。该方案还包括典型的SIP实验数据，并强调了确保DNA-SIP分析成功所必须注意的关键提示与注意事项。
关键词：DNA稳定同位素探针技术，DNA-SIP，密度梯度超速离心，梯度分段收集，标记DNA回收，分子表征，环境微生物学，代谢功能分析
方案
1. 试剂的准备
DNA-SIP 需要使用一些试剂，这些试剂应在实际操作前预先配制。本节列出了每种试剂的配制方法，这些方法改编自先前的SIP实验方案1。
- 用于制备SIP梯度的氯化铯（CsCl）溶液——将603.0 g CsCl逐步溶解于去离子蒸馏水（ddH2O）中，定容至500 mL，配制成7.163 M的CsCl溶液。注意定容时不要超过500 mL！在搅拌过程中轻微加热有助于完全溶解CsCl。将最终溶液分装至密封容器中。在本实验室，常规储存方法是将100 mL溶液分装至125 mL血清瓶中，并用丁基橡胶塞压盖密封。密封后的溶液可在室温（20°C）长期保存。密封可防止溶液蒸发及CsCl“结壳”现象。通过称量三份100 μL的溶液，或使用经精确校准的数字折射仪（例如Reichert AR200）测定溶液密度。Reichert AR200在成功校准后，可在数年内保持稳定并提供准确读数。在室温（20°C）下，该溶液的密度通常为1.88–1.89 g ml-1。每次新配制的储备液密度会略有差异。
- 用于与溴化乙锭（EtBr）共同制备梯度的氯化铯溶液——将250 g CsCl与250 mL无菌去离子水（ddH2O）混合。按照1.1节所述方法，将该溶液分装至已用丁基橡胶塞压盖密封的血清瓶中。
- 梯度缓冲液——将50....
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讨论
稳定同位素探针（SIP）实验的合理设计对于获得高于背景未标记群落的标记DNA至关重要。有关样品孵育时间、底物浓度、孵育条件（如营养物、土壤含水量）、交叉喂养及重复设置等方面的考虑已在其他文献中讨论过10,18，我们建议读者在设计SIP孵育实验时参考这些出版物。与本实验方案相关的是，还需特别关注SIP密度梯度数据分析中的一些额外注意事项。由于超速离心过程本身的特性，必须设置适当的对照，例如纯培养物和天然底物孵育的样品，以确保在特定组分中出现或消失的条带并非实验流程本身所导致的人为假象。例如，DNA在超速离心梯度中可能在琼脂糖凝胶上不可见（图2A），但仍可能污染整个梯度的所有组分（图2B）。尽管M. capsulatus的条带在图2B所示凝胶的高密度组分（5–7）中最明显，但在最轻的组分（12）中仍观察到了相同的DGGE图谱。通过周密设计的对照实验，可以对SIP梯度组分数据进行准确解读。
由于某些设计良好的SIP实验的特性（例如接近原位的底物浓度、较短的孵育时间），同位素掺入量可能非常低10。此外，与实验.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）向 J.D.N. 提供的战略项目资助和发现基金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 溴酚蓝 | 试剂 | 费舍尔科技公司 | BP115-25 | |
| 氯化铯 | 试剂 | 费舍尔科技公司 | BP210-500 | |
| 乙醇，试剂级 | 试剂 | 西格玛-奥德里奇公司 | 652261 | |
| 溴化乙锭 | 试剂 | 西格玛-奥德里奇公司 | E1510 | |
| 盐酸 | 试剂 | 费舍尔科技公司 | 351285212 | |
| 线性聚丙烯酰胺 | 试剂 | Applichem公司 | A6587 | |
| 聚乙二醇 6000 | 试剂 | VWR国际公司 | CAPX1286L-4 | |
| 氯化钾 | 试剂 | 费舍尔科技公司 | AC42409-0010 | |
| 氯化钠 | 试剂 | 费舍尔科技公司 | S2711 | |
| 氢氧化钠颗粒 | 试剂 | 费舍尔科技公司 | S3181 | |
| Tris碱 | 试剂 | 费舍尔科技公司 | BP1521 | |
| 暗读仪 | 设备 | 克莱尔化学公司 | DR46B | |
| 微量离心机 | 设备 | 艾本德公司 | 5424 000.410 | |
| Nanodrop 2000 | 设备 | 费舍尔科技公司 | 361013650 | |
| 输液泵 | 设备 | 布雷恩特里科学公司 | N/A | 型号：BSP 订购详情请见 www.braintreesci.com。 |
| 管路封口机 | 设备 | 贝克曼库尔特公司 | 358312 | |
| 超速离心机 | 设备 | 贝克曼库尔特公司 | ||
| 超速离心机转子 | 设备 | 贝克曼库尔特公司 | 362754 | |
| 紫外光源 | 设备 | UVP公司 | 95-0017-09 | 任何紫外光源均可使用 |
| 紫外光防护面罩 | 设备 | 费舍尔科技公司 | 114051C | |
| 丁基橡胶塞，灰色 | 材料 | 西格玛-奥德里奇公司 | 27232 | |
| 离心管 | 材料 | 贝克曼库尔特公司 | 342412 | |
| 皮下注射针头，23号，2”长度 | 材料 | BD生物科学公司 | 305145 | |
| 微量离心管，1.5 mL | 材料 | DiaMed公司 | AD151-N500 | |
| 开放式中心密封圈，直径20 mm | 材料 | 西格玛-奥德里奇公司 | 27230-U | |
| 巴斯德吸管，玻璃 | 材料 | 费舍尔科技公司 | 13-678-6C | |
| 移液器吸头 | 材料 | DiaMed公司 | BPS340-1000 | 目录号适用于200 μL吸头。10或20 μL吸头可从同一供应商处购买 |
| 泵用管路，内径1.5 mm × 壁厚1.5 mm | 材料 | Appleton Woods公司 | ||
| 螺口管，15 mL | 材料 | DiaMed公司 | AD15MLP-S | |
| 血清瓶，125 mL容量 | 材料 | 西格玛-奥德里奇公司 | Z114014 | |
| 注射器，60 mL | 材料 | BD生物科学公司 | 309653 |
参考文献
- Neufeld, J. D. DNA stable-isotope probing. Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).
- Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a t....
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