超声引导下小鼠前脑微注射 子宫内 在E9.5时

摘要

in utero 胚胎存活手术可实现对小鼠发育过程中基因表达的分子操控。本文中，我们描述了如何利用高频超声成像引导在胚胎第（E）9.5天将逆转录病毒载体注射到小鼠脑内。

摘要

在子宫内 小鼠的存活手术可实现发育过程中基因表达的分子操控。然而，由于早期胚胎发生期间子宫壁不透明，将显微注射针靶向胚胎特定部位的能力受到极大限制。幸运的是，高频超声成像能够生成实时图像，可用于引导显微注射针进入目标胚胎区域。本文描述了利用此类成像技术，在胚胎第9.5天（E9.5）将逆转录病毒载体注射至小鼠前脑脑室系统的方法。该方法通过剖腹手术暴露子宫角，并使用一种特殊设计的载片，使宿主胚胎在成像和注射过程中保持在生理盐水中。成功的手术通常可使大多数或全部注射后的胚胎存活至后续任意关注的时间点（胚胎期或出生后）。本文所述原理经轻微调整后，亦可用于在E8.5胚胎的羊膜腔内注射（从而在尚未闭合的神经管全长范围内实现感染），或在E10.5/11.5时注射至脑室系统。此外，在神经发生中期（约E13.5），超声成像还可用于引导将病毒或细胞移植直接注射至特定脑区。利用超声成像引导小鼠胚胎宫内注射是一项极为强大的技术，使得对小鼠胚胎进行分子与细胞水平的操控成为可能，而此类操控若无该技术则将极为困难甚至无法实现。

方案

第1部分：准备手术区域

1. 若使用生物危害性试剂（例如逆转录病毒载体），手术应在II级生物安全柜（BSC）内进行。超声背向散射显微镜（UBM）应放置在BSC旁边，换能器置于BSC内部，并由特制手术台上的电机控制支架固定。构建视频中所示手术台所需的组件已在线列出。该清单连同手术台多个角度的图像（可应要求提供），应足以支持完成构建。
2. 剖腹手术（即切开腹腔以接触内脏器官的外科手术）的切口开启与关闭通常在带有塑料背衬的吸水垫上进行。手术前，所有必要器械（如剃刀、手术剪、镊子、已装好自动夹施夹器等）和材料（如磷酸盐缓冲液PBS、缝合线、麻醉剂、小鼠固定装置及覆盖板等）均应灭菌并放置于手术区域。尽量缩短切口开放时间对于提高手术成功率至关重要。所有动物操作均应佩戴经MB-10溶液或同等效力消毒剂处理过的无菌手套，并根据需要定期重复消毒，以确保手套始终处于无菌状态。

第2部分. 小鼠麻醉

1. 用1 cc注射器吸取麻醉液，其中包含1份戊巴比妥钠（Nembutal，50 mg/ml）与4份经滤膜过滤灭菌的25 mg/ml硫酸镁PBS溶液。最终得到的溶液含戊巴比妥钠10 mg/ml和硫酸镁20 mg/ml。每只小鼠应单独称重，并按每公斤体重注射90 mg戊巴比妥钠的剂量给药（例如，一只28 g的小鼠需注射250 μL）。
2. 在妊娠小鼠胚胎发育第9.5天（E9.5，可根据需要使用其他时间点）时，将麻醉剂注射至其腹腔（腹腔内注射，IP），穿刺需穿透皮肤和腹肌。等待8–12分钟，直至小鼠失去反应。通过动物体位松弛以及对尾部和脚趾夹捏无反应来确认麻醉充分。用指甲轻轻夹捏皮肤极为敏感，若对此无任何反应，则表明动物已充分麻醉。需注意，即使对尾部和脚趾夹捏完全无反应的动物，在初次手术切口时仍可能轻微抽动。但这是反射性反应，并不代表麻醉不足。应使用石油基眼用软膏涂抹小鼠眼部，以防手术期间角膜干燥。
3. 在等待小鼠麻醉的过程中，设置好手术区域和超声设备。由于使用逆转录病毒或慢病毒需在生物安全二级（BSL2）条件下操作，如前所述，病毒注射应在II级生物安全柜中进行。此外，所有与病毒接触的溶液和一次性材料均须用10%次氯酸钠溶液（漂白剂）去污染。手术器械和超声设备应使用MB-10（http://www.quiplabs.com/mb10.htm）或所在机构所采用的等效消毒液进行处理。

第3部分. 胚胎暴露

1. 如果条件允许（取决于动物设施的限制和可用空间），建议将手术准备区与手术区设在不同位置，以最大限度降低动物间的交叉污染风险。开始手术时，将动物仰卧置于无菌吸水表面上，用70%乙醇彻底清洗腹部区域。可采用更广泛的术前处理（例如，交替使用碘伏和70%乙醇多次清洗），但根据我们的经验，此类啮齿类动物存活手术并不需要。使用双面剃刀，在约1英寸宽、1.5英寸长的腹部区域剃除毛发，剃毛时应以大约45°角进行短促快速的动作。必须妥善处理手术区域，但避免过度湿润，以免导致动物不必要的体温下降，甚至可能引发低体温症。
2. 使用精细手术剪，先在皮肤上做一条1英寸的纵向切口，然后切开动物的腹肌（切断连接皮肤与肌肉的结缔组织有助于完成第二步切口）。在整个操作过程中，应注意确保手术器械始终保持无菌状态，并根据需要进行消毒处理（例如，当器械尖端接触到非无菌材料时）。
3. 使用镊子小心地拉出子宫角，记录每侧胚胎的数量。在保留两个相邻胚胎暴露在外的同时（具体选择哪两个胚胎取决于每侧的排列情况），将大部分子宫角重新放回动物体内。在此过程中，每次仅暴露两个胚胎，并使其浸没于PBS中，同时保持母体处于仰卧位。
4. 将动物仰卧放入聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）固定装置中，手术期间将保持此位置（图1A）*。随后，将一个10 cm组织培养皿**（使用前应以MB-10消毒）通过一对镊子略微穿过绿色硅胶膜（使用L RTV硅橡胶基质和固化剂制备；Dow-Corning产品编号分别为3142761和2156946）缓慢下放至母体上方。当下放培养皿时，用镊子夹住待注射的两个胚胎之间的子宫组织，并轻轻将其拉过膜孔。同时，将培养皿完全下压至固定装置上，并插入图钉以固定其位置。然后向培养皿中加入预热至37°C的PBS，完全覆盖胚胎。
5. 将含有动物及暴露胚胎的注射平台置于超声探头下方（图1A），以实现通过子宫壁对暴露胚胎的实时成像（图1B）。随后，使用电机控制将探头缓慢下放至PBS浴液中，直接位于待成像胚胎上方。当探头距离胚胎约2–3 mm时即可获取图像。在探头来回振荡采集图像的过程中，必须特别注意确保探头头部不会触碰胚胎。

* 手术过程中用于固定母鼠的支架可由机械加工车间轻松制作。该支架应包含一个宽大的有机玻璃底座，并在其顶部粘接两块有机玻璃侧板，侧板之间留有足够空间（宽度需能容纳小鼠仰卧）。侧板上应加工出凹槽，并用黑色石蜡（例如解剖盘中使用的石蜡）填充。该石蜡将用于固定图钉，以固定盛有PBS的培养皿，使胚胎在注射过程中浸没于PBS中。

** 10 cm 细菌培养皿的底部中央应打一个孔（直径约 2 cm）（可使用重型便携式打孔器和 13/16^th 英寸圆形冲模： http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm此外，应在中心孔两侧约1.5 cm处用火焰加热的针头烧出两个小孔（当然也可使用钻头制备）。这些小孔随后需涂抹真空脂，作为固定培养板的图钉穿过并插入黑色石蜡的位置。涂抹真空脂的目的是防止PBS泄漏。

第4部分：将病毒载入显微注射针

1. 使用内径为1 mm的拉制玻璃毛细管，通过磨出斜面制备显微注射针。针尖的锋利程度至关重要，若针尖不够锋利，可能严重阻碍对子宫壁和羊膜囊的穿刺，从而导致实验失败。将 sharpened 针插入移液器套管中，该套管通过导管连接至安装在手动推注/回吸泵上的25 μL微量注射器（也可使用其他设备来控制针头的加载与释放，但视频中展示的是此装置）。为获得最佳响应性（避免空气系统带来的膨胀与压缩），微量注射器、导管和针头应完全充满矿物油。
2. 在加载针头前，需确保从注射器到针尖的整个系统中无气泡。然后在开始加载病毒前，先回吸一小段空气泡（长度为1–2 mm）进入针头。此气室有助于将病毒与矿物油分隔开。待注射的病毒原液应含有终浓度为0.08 mg/mL的polybrene（有关病毒制备的更多信息，请参见参考文献1、2）。需注意，浓缩的逆转录病毒原液通常含有大量颗粒物，其中包含大部分具有感染性的成分，因此若进行过滤会导致滴度下降5至10倍。此外，根据制备方法的不同，病毒原液可能因裂解的包装细胞释放的基因组DNA而变得黏稠（尤其在使用293细胞制备MLV/VSV假型病毒时更为明显）。若病毒分装液黏稠，应加入少量DNAse I以降低其黏度，否则将极难加载针头。取8–10 μL病毒液滴加于无菌的Parafilm膜上，以备加载针头。随后使用回吸泵小心地加载针头，并注意避免堵塞。将加载好的针头置于注射区域的显微操作器位置，操作时需小心，避免针头触碰胚胎或超声探头而折断。需注意，若因某些原因需在注射前较长时间提前加载针头，可在针尖吸入少量空气，注射前再将其排出。此气室可防止病毒液在针尖处干燥（一旦发生干燥，该针头几乎无法继续使用）。

第5部分. 超声引导下的病毒注射

1. 超声探头生成的实时图像显示在视频监视器上，可用于引导显微注射针进入胚胎。利用该系统，可在 E8.5 时将病毒注射至羊膜腔，或在 E9.5–E11.5 期间注射至羊膜腔或脑室系统（图1B）。这是整个操作中最困难的部分，需要大量实际操作经验才能掌握（通常需 5–20 小时，具体取决于研究人员）。针尖在超声图像中表现为屏幕上最亮的点，并应随探头位置的调整（通过 y 和 z 平面上的电机控制以及 x 平面上的手动控制）而同步移动。至关重要的是，探头的振荡方向必须与针的长度方向平行，以确保在调整位置进行胚胎注射时，针尖始终位于成像平面内。
2. 应调整胚胎位置，使目标区域（本例中为前脑脑室）清晰可见，并使注射路径中尽可能少地穿过子宫组织。此外，切勿通过胎盘进行注射。当目标脑区与注射针推进方向对齐后（通过显微操作仪上的旋钮调节），针尖应刚好接触子宫壁，随后快速短促地向前刺入以穿透组织。采用类似方法依次穿透羊膜腔和脑组织。在某些情况下，经验丰富的研究人员可一步到位直接刺入脑室，尤其是在针尖非常锋利时。移动探头、注射针以及通过移动台上的母鼠来调整胚胎位置的操作技巧，均需通过实际练习掌握。
3. 完成所需数量胚胎的注射后，使用 5.0 丝线缝合腹壁。缝合技术并非本手术特有。最后，使用兽用自动夹钉器在皮肤表面沿肌肉层缝合处进行夹合固定。不建议缝合皮肤，因为小鼠会啃咬拆除缝线。应在切口部位给予镇痛处理，以减轻小鼠苏醒后所经历的疼痛。推荐沿切口部位每隔几毫米皮下注射 0.25% 布比卡因溶液（0.8 ml/kg，或 2 mg/kg）。
4. 在小鼠恢复期间，将其轻柔地放置于铺有吸水纸的洁净笼内，并放入凝胶包（以促进喂食和补水）。将笼子置于设定为 37°C 的滑动加热器上，以维持体温。苏醒后，将小鼠与凝胶包一同转移至洁净笼中，并放回动物架。
5. 术后次日检查小鼠是否存在阴道出血、腹部收缩和/或整体状态不佳的表现，这些均为流产的征象。若出现上述情况，应立即实施安乐死。毛发整洁、整体健康状态良好则表明手术恢复成功。注射后的胚胎可在胚胎期或出生后处死并用于进一步分析。若病毒表达报告基因（如人源碱性磷酸酶 PLAP 或 GFP），染色可显示病毒感染阳性区域（图1C）。

代表性结果

注射后的胚胎可在注射后1至2天直至成年期间的任意时间点处死取材。如果病毒表达报告基因（如PLAP或GFP），则可通过报告基因的表达来鉴定病毒感染的细胞及其克隆后代。例如，图1C显示的是出生后脑组织切片，该脑组织曾被病毒感染 在子宫内 在E9.5时使用表达PLAP的逆转录病毒载体进行感染。经组织化学染色后，被感染的细胞呈现为紫色簇状结构。除了用于识别病毒感染的细胞外，报告基因的表达还可用于观察细胞形态与位置，以及基因表达状态。

图 1. 在 E9.5 小鼠前脑脑室中进行病毒注射。A. 将麻醉后的动物放置在注射台上。两个胚胎将被暴露并置于超声探头下方所示位置（箭头）。充满病毒的显微注射针位于胚胎附近，并与超声探头对齐。B. 来自 E9.5 小鼠胚胎的实时超声图像的屏幕截图。V，脑室；AS，羊膜囊；UW，子宫壁。C. 在 E10.5 时，胚胎被注射了表达 PLAP 的病毒。对 PLAP 进行组织化学染色，以显示病毒感染的位置。

讨论

使用超声引导进行病毒注射的时间范围为胚胎发育第8.5天至第11.5天（E8.5–E11.5）。在E8.5时仅可注射羊膜腔，而在E9.5至E11.5期间则可同时注射羊膜腔和脑室系统。若操作正确，通过超声引导将病毒颗粒注入脑室系统后，病毒可接触并感染脑室系统内壁的细胞，从而感染前脑（新皮层、基底神经节、间脑、眼等）、中脑和后脑的多种结构（图1C）。注入羊膜腔的病毒则可接触胚胎外部的细胞。除了病毒外，超声引导还可用于向发育中的胚胎注射细胞。因此，该技术在实验设计中提供了多种可选参数（发育时间点、靶向结构、病毒或细胞类型）。

注射的病毒或细胞必须表达报告基因，以便于识别被感染或注射的细胞。传统上，曾使用人胎盘碱性磷酸酶（PLAP）或GFP作为报告基因。根据经验，我们发现PLAP是一种非常有用的报告基因，因为PLAP的组织化学和免疫组织化学染色均能产生清晰且明确的单细胞染色，便于分析细胞形态和位置，并进行克隆分析。由于病毒表达的GFP信号可能较弱，因此GFP作为报告基因在组织染色方面可能并不理想，但如果需要通过荧光激活细胞分选（FACS）获取单个细胞，则GFP仍具有应用价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微操作仪	Narishige International	91084361683D
HI-7 移液管架	Narishige International	9108436141
10 mm 支撑臂	Carl Zeiss, Inc.	9108436206
IP铁底板	Carl Zeiss, Inc.	9108436167
移液器 holder 的 CI-1 连接器	Carl Zeiss, Inc.	9108436257
内径1 mm的管子	Carl Zeiss, Inc.	911013
三通鲁尔锁止旋塞阀（每包10个）	卡尔·蔡司股份有限公司	K420163-4503
电机控制器，2-4 轴	Newport Corp.	860-c2
操纵杆	Newport Corp.	PMC200-J
微米调节器	Newport Corp.	ADAPT-BM17-375
电动驱动器	Newport Corp.	CMA-25CC
电缆组件	Newport Corp.	860I-10
25 mm 平移台	Newport Corp.	UMR8-25
微米	Newport Corp.	BM17-25
基板	Newport Corp.	M-PBN8
内侧安装支架	Newport Corp.	EQ80-I
外侧安装支架	Newport Corp.	EQ80-E
手动灌注/抽吸泵	Stoelting 公司	51222
25 μl 微量注射器	Stoelting 公司	51113
24"x12"x0.5" 公制板	Edmund Scientific	NT03-640
自调节脚垫组	Edmund Scientific	NT34-841
条形透镜架	Edmund Scientific	NT03-669
直角支架夹	Edmund Scientific	NT53-357
2" 职位持有者	Edmund Scientific	NT03-646
4” 钢柱	Edmund Scientific	NT36-499
6” 钢柱	Edmund Scientific	NT36-503
12/pk 内六角螺钉，1/4-20 × 1/2"	Edmund Scientific	NT03-644
PBS，pH 7.4	Invitrogen	10010049
载玻片加热板	Fisher Scientific	多种选择
双刃剃须刀片	电子显微镜科学公司	72000
硼硅酸盐玻璃，外径：1.0 mm，内径：0.05 mm	Sutter Instrument Co.	B100-50-10
1cc 胰岛素注射器 U-100 27G 5/8	BD Biosciences	329412
自动夹施加器	BD Biosciences	427630
9毫米自动夹（用于闭合皮肤切口）	BD Biosciences	427631
5.0 丝线缝合线	Fisher Scientific	S-1173
无菌润滑眼膏	Fera 药物公司	48102-012-35
MB-10 或同等效力的消毒剂	Quip labs
10% 次氯酸钠溶液	多家供应商
"以下超声背向散射显微镜之一可用于本实验。尽管视频中使用的是 Paradigm-Medical 公司的 P40 型号，但该型号目前已不再 commercially available，已被 P60 取代；P60 价格相近，且适用于相同的应用。所述用于载物台构建的附加材料适用于 Paradigm-Medical 设备。Vevo 2100 配备有用于小动物成像的设备。 P60 超声生物显微镜 （UBM）来自 Paradigm-Medical (http://www.paradigm-medical.com/ubms.html). Vevo 2100 来自 VisualSonics（http://www.visualsonics.com/) 麻醉剂与镇痛剂 戊巴比妥钠溶液（50 mg/mL 可注射用，由 Abbott Laboratories 生产）可从 Bulter Schein Animal Health 公司获取。请注意，此为二类管制药品，需持有美国药品执法局（DEA）许可证方可获取。 布比卡因溶液（0.25%；由Hospira, Inc.等公司生产）可从包括Moore Medical在内的多家经销商处获得。