细面条与细意面操作测试：大鼠和小鼠前爪灵巧功能的简单定量评估方法

摘要

Vermicelli 和 Capellini 前肢灵巧性测试利用了啮齿类动物倾向于使用灵巧的前肢和指部动作来操控食物的自然习性。实验过程中对动物抓取短段未煮熟的干意大利面的行为进行录像，通过慢动作回放可量化分析前肢的调整动作。

摘要

先前对啮齿类动物进食行为的表征研究表明，它们会使用协调的前肢动作来操控食物碎片。在此基础上，我们进一步开发出一种简单且可量化的前肢灵巧性检测方法，该方法对偏侧化功能损伤及年龄相关的变化具有高度敏感性。啮齿类动物通过学习熟练的前肢和趾部动作来处理细面条状的食物，并积极摄食。我们此前已描述了用于量化大鼠处理细面行为的方法，并证明这些指标对由单侧缺血性损伤、大脑中动脉闭塞以及单侧纹状体多巴胺耗竭引起的前肢功能障碍具有高度敏感性 [Allred, R.P., Adkins, D.L., Woodlee, M.T., Husbands, L.C., Maldonado M.A., Kane, J.R., Schallert, T. & Jones, T.A. 细面处理试验：一种评估大鼠前肢灵巧功能的简单定量方法]J. Neurosci. 方法170, 229-244 (2008)]。本文提供了该测试在大鼠中的更详细实验方案，并介绍了一种新开发的小鼠版本——Capellini 操作测试。在测试过程中，分别对大鼠和小鼠操作短段生细面或卡佩利尼意面的行为进行录像，摄像机位置经过优化以清晰捕捉前爪的运动。通过慢动作回放视频，可识别前爪调整动作，定义为进食开始后，前爪或其任意数量脚趾在面条上发生的任何明显移开并重新放置的动作。每次测试阶段中，每根面条的前爪调整次数取多次试验的平均值。重复测试可实现对前爪灵巧性随时间变化的敏感定量分析。本文还描述了测试前适应性训练和操作练习的方案，以及表征非典型操作模式的操作流程。由于大鼠和小鼠在执行意面操作测试时存在细微差异，文中特别强调了该测试在不同物种间的操作与评分差异。所有动物实验均依照德克萨斯大学奥斯汀分校动物护理与使用委员会批准的协议进行。

方案

1. 测试开始前的准备工作

1. 使用剃刀将未煮熟的意大利面切成指定长度。对于大鼠，使用Skinner品牌的细圆面（直径1.5 mm），切成7 cm长；对于小鼠，使用DeCecco品牌的极细面（直径1.0 mm），切成2.6 cm长（图1C）。由于不同品牌的意大利面在质地和直径上存在差异，可能影响动物抓取方式，因此建议在重复实验中始终使用同一品牌的意大利面。
2. 为克服动物的恐新行为并建立抓取技能，在测试前数周内需多次将意大利面片段放入其饲养笼中进行暴露训练。（通常暴露5–10天，每次约4根，即可达到效果。）
3. 若测试将在非饲养笼的环境中进行，或需移动饲养笼进行测试，则应让动物提前适应在该测试环境中进食。（通常需要3–5次适应性训练，动物即可在该环境中顺利进食意大利面。）
4. 即使动物已积极接受意大利面，当大型摄像机被移至测试区域附近时，它们仍可能突然表现出回避行为。因此，建议在一次或多次适应性训练中提前将摄像机放置在测试环境前方。
5. 由于大多数动物表现出对意大利面的高度偏好，测试前无需进行食物限制。然而，在测试前数小时或过夜禁食可能有助于促使动物在实验人员和摄像机前进食，并确保测试时未处于饱食状态。
6. 进食过程中折断意大利面会使该次试验无效。我们发现，若从未提供比测试所用更长的面段，此类行为可基本避免。
7. 在测试过程中，使用极细头记号笔和硬纸板模板，在意大利面上以特定间隔做标记（细圆面每1.75 cm标记一次，极细面每0.86 cm标记一次），以便于观察进食过程中面条的移动情况。

2. 测试设置

1. 动物应在饲养笼内或另一具有完好透明壁的装置中进行测试，并在测试期间与同笼动物隔离。
2. 尽管经过训练的实验人员可实时对大鼠进行测试（Allred et al., 2008），但通过视频记录可更方便地进行量化分析，以便在慢速回放时收集数据。由于小鼠前爪较小且动作迅速，我们发现若无慢速视频回放，难以可靠地量化其前爪运动。
3. 应使用高帧率并具备足够变焦功能的摄像机。我们采用 Canon XL1S 摄像机，配备 16 倍变焦镜头，在普通室内光照条件下设置快门速度至少为 420 s⁻¹。使用带旋转倾斜云台的带轮三脚架有助于调整摄像机位置。
4. 大鼠通常直立坐在后肢上进食意大利面，因此将摄像机置于接近实验箱地面高度并略向上倾斜的角度，可最清晰地观察前爪（图 1A）。若在铺有垫料的笼中进行测试，移除部分垫料可能有助于优化视野。
5. 小鼠在进食意大利面时倾向于向前弯曲身体，持面角度较之大鼠更为倾斜。因此，测试箱应采用开放式底面，并置于一面镜子上方。摄像机位置略高于箱底，向下倾斜对准镜子中前爪的反射影像（图 1B）。使用一次反射镜可显著提高视频回放时前爪图像的清晰度。
6. 每次咬合意大利面均可听到声音，因此音频记录有助于确认进食行为。

3. 进行意大利面操作试验

1. 测试环节由连续的试验组成，每次试验中动物摄取一块意面。我们通常记录每只大鼠4-5次试验、每只小鼠3-4次试验的数据。
2. 在开始录像前，将一块意面放入测试腔内以启动进食行为，并使动物移动至合适的摄像视野中。
3. 动物必须正对摄像头，且摄像机需充分对焦并放大（约10-12倍），以便观察其双前肢及所有指头的细微动作调整。应能清晰看到双侧前肢的指关节。至少使用本摄像机时，我们发现仅在试验开始前使用自动对焦功能来锁定目标区域较为有效，之后应切换为手动对焦。
4. 一旦动物和摄像机就位，即开始第一次试验。将一块意面直接置于动物前方使其抓取或悬挂于其前，且在动物开始进食前即启动录像记录。
5. 随后试验应连续进行，中间不作停顿。建议尽量减少各次试验之间的间隔时间，以防动物离开最佳观察位置。
6. 若试验中前肢呈侧向视角或对焦不清，则该次试验不予评分。
7. 测试环节可在多日内重复进行，例如用于记录处理前后的时序变化模式（如中枢神经系统损伤后的恢复过程；Allred et al., 2008）。
8. 一个挑战是让动物在相对于摄像头的理想位置进食。可能需要在正式测试前让对摄像头敏感的动物先适应摄像头存在几分钟。通常可通过在理想区域投放或悬吊意面来引导动物进入合适位置。虽然可能需要几块意面才能达到理想位置，但应尽量减少提供的数量以避免动物产生饱腹感。
9. 在对多只大鼠进行顺序测试时，我们发现将若干个笼子临时排列成环形，将装有轮子的三脚架摄像头置于中央较为方便。将意面逐个投入每个笼子的理想区域，然后将摄像头移至最先在合适位置开始进食的大鼠处。这种方法可为进食较慢的大鼠提供更多时间以适应摄像头和实验人员的存在，同时它们也可能受到进食较快大鼠咬合声音的刺激而开始进食。

4. 前爪调整和进食时间的定量视频分析

1. 进食过程中前爪调整行为的分析是一种简单的定量检测方法，对大鼠中枢神经系统损伤后出现的偏侧功能缺损具有敏感性（Allred 等，2008；Whishaw & Coles，1996；Whishaw 等，1997）以及小鼠与衰老相关的变化（Tennant 等., 2009).
2. 试验的量化阶段从意面首次放入口中开始，到最后一点意面被爪子释放并完全进入口中时结束。 
3. 根据需要，视频回放速度减慢（约为实时的50%），或逐帧前进，以识别调整操作。
4. 每次爪子松开并重新接触意面、爪子对意面的抓握重新形成，或脚趾发生伸-屈、外展-内收运动时，均计为一次调整（图2）。左爪和右爪的每次调整均分别记录。
5. 调整是 不 当爪子在意大利面片上滑动而手指无动作或爪握位置未重新调整时，不计入计数。爪子未接触意大利面片时的动作（即在片旁的移动）也不计入计数。
6. 每次试验的进食时间均被记录，起始点为开始进食，终点为意大利面完全进入口中。我们通过视频回放显示功能记录时间，但也可在正常速度回放过程中使用秒表进行记录。
7. 如果动物在进食过程中暂停但仍然咬住食物块，则将暂停的时间从总时间中扣除。进食暂停表现为食物块移出嘴外或听觉上可察觉的咀嚼动作停止。
8. 如果在进食过程中的任何阶段爪子的视野被遮挡，或动物将食物弄碎，则该次试验将从分析中剔除，因为较短的食物碎片会改变抓取方式。
9. 一些大鼠和小鼠始终倾向于使用某一只前爪进行更多的调节动作。对于单侧中枢神经系统损伤模型而言，若损伤发生在前肢功能测试中原本就更常使用、调节动作更多的那只前爪所对应的脑半球，则能够更敏感地检测到偏侧化的功能障碍（Allred 等., 2008).
10. 小鼠在进食过程中有时会将意面片段掉落，短暂休息后又拾起继续进食。这种情况在每天的最后一次试验中最常见，可能是由于部分饱腹感导致注意力下降所致。由于该现象在正常的对照小鼠中也较为常见，因此我们不将这些试验剔除。然而，意面掉落的时间段需从总进食时间中扣除。
11. 在完整的 rats 中，丢弃食物碎片是不典型的行为，且进食恢复通常显著延迟或不出现。此类试验被排除在对调整行为和进食时间的分析之外。
12. 进食开始前的调整动作不计入统计。进食前的操作行为会受到中枢神经系统损伤的影响（例如，Whishaw 等，1992；Whishaw 等（1986），但我们尚未将前爪调整的定量方法扩展到这一时期。
13. 这些数据可归纳为：（a）每只爪子处理每块食物的平均调整次数，（b）每块食物的平均进食时间，以及（c）调整频率（调整次数/进食时间）。

5. 非典型操作模式的视频分析

1. 非典型抓握模式可用来区分大鼠的不同中枢神经系统（CNS）损伤类型（Allred et al., 2008），记录这些行为可作为补充分析手段。
2. 若某种抓握模式在完整动物中很少出现，则被视为非典型。完整动物通常用一只前肢（“抓握肢”）从较低位置握住意大利面，另一只“引导肢”则靠近口部放置（图3A,C）。在所有试验中，通常同一只前肢作为抓握肢。大鼠最初常将两前肢沿意大利面长度方向分开较远，随着食物变短而逐渐靠拢。小鼠则通常从进食开始就将两前肢靠近口部，抓握肢与引导肢彼此靠近。在两种物种中，当意大利面变得非常短时，前肢会移动到更对称的位置，呈并列或指头交错状（图3B,D）。在整个进食过程中，双前肢持续用于引导、握持或推进意大利面。
3. 大鼠和小鼠前肢位置的非典型模式包括：(a.) 当意大利面较长（超过原始长度的一半）时，将两前肢并拢呈对称握持；(b.) 在食物完全消耗前未能将前肢移至对称位置；(c.) 在进食过程中交换引导肢与抓握肢的位置。
4. 大鼠和小鼠中另外两种非典型行为为：(a.) 在进食过程中长时间未用一只前肢接触意大利面（“接触失败”）；(b.) 使用口部将意大利面从双前肢间拉出以重新调整前肢位置（“口部拉拽”）。
5. 以下两种行为在大鼠中被视为非典型，但在小鼠中属于典型行为：(a.) 弓背姿势；(b.) 开始进食后掉落意大利面。然而，小鼠在中枢神经系统受损后掉落频率可能增加。因此，我们在两种物种中均记录掉落频率。
6. 在大鼠单侧纹状体多巴胺耗竭模型中还观察到其他非典型行为：(a.) “铁握”现象，即抓握肢在进食期间保持静止且僵硬；(b.) 引导肢围绕僵硬的抓握肢反复移动；(c.) 进食时头部极度倾斜，使意大利面以特定角度送入口中（Allred et al., 2008；另见 Whishaw et al., 1997）。
7. 我们观察到老年小鼠常做出无法有效将意大利面送入口中的调整动作。因此，那些未导致意大利面明显向口中移动的调整动作被单独记录。
8. 引导肢与抓握肢的交换、接触失败、掉落及口部拉拽按发生次数记录，而其他所有非典型行为则每试验记录一次。

6. 代表性结果

视频分析的结果应包括每次试验中每只爪子的调整次数以及吃每根意大利面所需的时间。具有感觉运动皮层损伤或脑缺血的大鼠实验结果表明，动物在受损（对侧损伤）肢体上的调整次数减少，这种效应在损伤后至少持续一个月。单侧多巴胺耗竭会导致对侧肢体调整次数减少，同时同侧肢体调整次数增加（Allred et al., 2008）。小鼠实验结果显示，与年轻成年小鼠相比，老年小鼠吃意大利面所需时间更长，且出现更多未能将意大利面送入口中的无效调整动作（Tennant et al., 2009）。这些测试的分析还可包括对异常操作行为的观察。纹状体损伤和大脑中动脉闭塞还导致异常进食行为的发生频率增加（Allred et al., 2008）。

图1. （A）大鼠和（B）小鼠处理意大利面的姿势。注意大鼠会后肢着地坐立，而小鼠则弓身俯在意大利面上，因此需在小鼠下方放置一面镜子，以便观察其爪部运动。（C）用于测试的意大利面样本示例。

图2. 大鼠（A-C）和小鼠（D-F）前肢调整动作的示例。第一张图为调整前的动物状态，中间图为前肢正在调整，星号标记了正在进行调整的前肢，最后一张图为重新放置在意大利面片段上的状态。

图3. 当意大利面较长（A,C）和较短（B,D）时，大鼠和小鼠的引导肢与抓握肢位置。

讨论

在本视频中，我们演示了如何分别在大鼠和小鼠中进行细面条（Vermicelli）和 Capellini 操作测试。这些测试是一种简单且定量的方法，用于研究正常动物、脑运动系统受损后或衰老过程中前爪和脚趾功能的变化。通过慢动作视频分析动物前爪抓取生面条小段时的运动，研究人员能够量化每只前爪所做的调整，并观察实验性诱导的中枢神经系统损伤后可能出现的异常行为。测试可以在不同日期重复进行，大多数动物在几分钟内即可完成一个测试阶段的所有试验。因此，该测试适合纳入更大的测试组合或实验设计中。这些测试也可用于运动技能学习的研究（Xu et al., 2009），但本文我们提供了一种用于评估既定技能随时间变化的实验方案。

目前，熟练抓取测试是评估大鼠（例如 Whishaw et al., 1986；Ballermann et al., 2001；Montoya et al., 1991）和小鼠（Farr & Whishaw, 2002；Tennant & Jones, 2009；Baird et al., 2001）前肢灵巧功能最常用的实验方法。抓取测试可对单侧肢体进行独立评估，而意大利面操作则是一种双手协调任务。尽管如此，这两种测试在检测前爪功能损伤方面的敏感性相似，且掌握这两种测试技能的过程均涉及运动皮层前肢代表区的可塑性变化（Xu et al., 2009）。根据我们的经验，抓取测试操作更为复杂且耗时费力，对于某些实验问题，本文所述的测试方法可能提供一种更高效的替代方案。然而，与本文介绍的测试不同，熟练抓取测试已使用数十年之久（Peterson, 1934），目前已发展出一套多样且高度敏感的测量指标和测试参数（Ballermann et al., 2001；Farr & Whishaw, 2002；Montoya et al., 1991；Whishaw et al., 1992）。相比之下，Vermicelli 和 Capellini 操作测试源于对大鼠灵巧摄食行为的较新研究描述（Whishaw 和 Coles, 1996）。在测试实施和数据分析方面，这些方法无疑还可进一步优化和拓展，例如更精确地量化精细的指部运动和双手协调模式，以及量化舌头、口腔和下颌的协同运动。