实验性转移与CTL过继性转移免疫治疗小鼠模型

摘要

用于分析肿瘤细胞与T细胞相互作用的实验性肺转移及CTL免疫治疗小鼠模型 体内.

摘要

实验性转移小鼠模型是一种简单且具有生理相关性的转移模型。将肿瘤细胞通过尾静脉静脉内（i.v.）注射至小鼠体内，使其在肺部定植，从而模拟肿瘤细胞自发转移的最后阶段：在循环系统中存活、外渗以及在远端器官中定植。从治疗学角度来看，实验性转移模型是最简单且理想的模型，因为治疗的靶点通常是转移的终末阶段：即在远端器官中已建立的转移性肿瘤。在此模型中，将肿瘤细胞通过尾静脉静脉注射至小鼠体内，使其在肺部定植并生长。随后，将肿瘤特异性的CTL细胞通过静脉注射至携带转移灶的小鼠体内。肺转移灶的数量和大小可通过注射的肿瘤细胞数量以及肿瘤生长时间加以控制，因此可模拟从微小转移至广泛转移的各种转移阶段。肺转移灶通过墨汁灌注进行分析，从而便于肉眼观察和定量评估。

方案

1. 实验性转移小鼠模型

1. 在肿瘤细胞注射前一天，将最多 1 × 10⁷ 个 CMS4-Met 细胞接种至一个 T75 培养瓶中，加入 10 mL 含 10% 血清的 RPMI 培养基，以获得快速生长的肿瘤细胞。于 37°C 培养过夜。
2. 在注射当天，吸除培养基，用 PBS 洗涤细胞一次，随后在 37°C 条件下使用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 消化 5 分钟以收获肿瘤细胞。加入 10 mL 含 10% 血清的 RPMI 培养基终止反应。将细胞转移至锥形管中。
3. 在室温下，使用 Sorvall Legend RT 离心机以 1300 rpm 离心 3 分钟，弃去上清液。用 10 mL 新鲜的 1× HBSS 重悬细胞进行洗涤，再次离心后以相同方式重悬细胞。
4. 使用血细胞计数板对肿瘤细胞进行计数。用 HBSS 稀释细胞，使每次注射所需的细胞重悬于总体积为 100 μL 的溶液中。
5. 将 6–8 周龄的 BALB/c 小鼠置于盛有温水的烧杯中加温，以扩张尾静脉。将小鼠固定在实验台上的尾静脉固定装置中。使用微量注射器向侧尾静脉注射 100 μL 肿瘤细胞悬液。操作过程中须采用无菌技术以防止感染。注射完成后，对注射部位施加轻微压力，直至出血停止。
6. 将小鼠放回笼中，使其肿瘤生长至所需阶段。

2. 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）过继转移免疫疗法

1. 在转移当天，轻轻吹打以重悬已纯化的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），其制备方法如文中所述。将一个培养板中的所有细胞转移至一个15 mL锥形管中，注意液体体积不得超过管容量的2/3。
2. 将一支无菌巴斯德吸管插入锥形管中，沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液（LSM），使总体积接近14 mL，置于细胞下方形成下层。
3. 操作时注意避免扰动液层。在室温下以2000 rpm离心20分钟，离心结束后不得使用刹车减速转子。
4. 将CTLs转移至新的15 mL锥形管中，加入HBSS至约10 mL体积进行洗涤。
5. 对细胞进行计数，随后在室温下以1300 rpm离心5分钟。弃上清后，用HBSS重悬细胞至注射所需浓度，每只小鼠注射总体积保持为100 μL。
6. 采用本视频此前展示的相同尾静脉注射技术，将CTLs注射入荷瘤小鼠体内。
7. 将小鼠放回笼中，使其体内的CTLs与肿瘤发生相互作用。通常在CTL处理后14–21天处死小鼠并进行分析。

3. 肺转移灶的可视化

1. 为观察肺转移灶，将已处死的小鼠仰卧置于泡沫板上，固定四肢以充分暴露气管区域，随后用70%乙醇喷洒小鼠腹侧表面。
2. 从腹部中线开始，使用剪刀沿中线切开，穿过肋骨区域，向上延伸至唾液腺处，暴露气管。用镊子清除气管周围的组织。
3. 将一支200 μL移液器吸头从气管下方穿过。一手持吸头，轻轻将气管向上提起并远离身体。
4. 将操作平台旋转180°，使用50 mL注射器通过气管向肺部注入印度墨水，持续注墨直至肺部完全膨胀并产生明显阻力。
5. 用剪刀剪断气管，将一对镊子滑入肺下方，将肺整体取出。将肺在盛有1 L水的烧杯中短暂冲洗。
6. 在化学通风橱内，将肺转移至含有5 mL Fekete's溶液的玻璃闪烁瓶中。数分钟后，肿瘤组织将以白色结节的形式出现在黑色的肺组织上。此时可对肿瘤结节进行计数，并可无限期保存于Fekete's溶液中。

4. 可视化肺组织中的代表性转移灶

1. 此处显示的是注射了乳腺癌细胞系4T1的小鼠肺组织，可见白色斑点，提示存在肿瘤。而注射了转染IRF8显性负性突变体K79E的4T1细胞的小鼠，则显示出肿瘤细胞转移能力增强。
2. 这些图像展示了细胞毒性T淋巴细胞（CTL）过继转移免疫治疗效果的组织学分析结果。注射生理盐水的荷瘤小鼠在6天后出现多个肿瘤，由黄色箭头指示（A）；而注射肿瘤特异性T细胞的小鼠则显示肿瘤数量减少（B）。
3. 在同一实验中，印度墨水处理提供了一种更简便的方法来评估CTL过继转移的疗效。在此方法中，荷瘤肺组织上的白色肿瘤结节可与成功接受CTL过继转移后的肺组织清晰区分，通过计数结节数目可实现比组织学分析更定量的评估。

5. 代表性结果

图1. 实验性肿瘤转移及CTL过继转移免疫治疗小鼠模型的实验方案。红点代表肿瘤细胞，绿点代表CTLs。

图2. 干扰IRF8功能可增强肿瘤细胞的转移潜能。小鼠乳腺癌细胞系4T1被稳定转染空载体（4T1.Vector）或表达IRF8显性负性突变体K79E的载体（4T1.IRF8K79E）（15, 16）。将肿瘤细胞通过尾静脉注射至小鼠体内。用印度墨水灌注荷瘤肺组织以显示肿瘤结节。在黑色肺组织背景下，肿瘤结节以白色斑点形式清晰可见。

图3. CTL过继转移免疫治疗效果的组织学分析。将小鼠肉瘤细胞系CMS4-Met通过尾静脉注射至小鼠体内。三天后，向荷瘤小鼠注射生理盐水（A）或肿瘤特异性T细胞（B）。在CTL处理六天后，采用常规H&E组织学染色法分析肺组织。箭头所示为肿瘤结节。

图 4. 通过印度墨水灌注法可视化肿瘤结节。将小鼠肉瘤细胞系 CMS4-Met 经尾静脉注射至小鼠体内。三天后，向荷瘤小鼠注射生理盐水（对照组）或肿瘤特异性 T 细胞（+CTL）。在 CTL 治疗十四天后分析肺组织。白色斑点为肿瘤结节，便于对 CTL 治疗效果进行定量评估。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
溶液：
印度墨水溶液（17）：
将150 ml蒸馏水倒入250 ml的烧瓶中。 向蒸馏水中加入4滴氢氧化铵。 向氨水混合液中加入30 ml印度墨水储备液（即 Sanford Black Magic 防水绘图墨水 4465 型号 44011）。 用蒸馏水定容至200 ml。溶液即可用于注射。
Fekete 溶液（17）：
Fekete 溶液用于漂白注入印度墨水的荷瘤肺组织，以区分白色肿瘤结节与正常组织的黑色背景。
将350 ml 95%乙醇加入1 L玻璃瓶中。 加入150 ml蒸馏水 加入50 ml甲醛 加入25 ml冰醋酸