实验性转移与CTL过继性转移免疫治疗小鼠模型

摘要

用于分析肿瘤细胞与T细胞相互作用的实验性肺转移及CTL免疫治疗小鼠模型 体内.

摘要

实验性转移小鼠模型是一种简单且具有生理相关性的转移模型。将肿瘤细胞通过尾静脉静脉内（i.v.）注射至小鼠体内，使其在肺部定植，从而模拟肿瘤细胞自发转移的最后阶段：在循环系统中存活、外渗以及在远端器官中定植。从治疗学角度来看，实验性转移模型是最简单且理想的模型，因为治疗的靶点通常是转移的终末阶段：即在远端器官中已建立的转移性肿瘤。在此模型中，将肿瘤细胞通过尾静脉静脉注射至小鼠体内，使其在肺部定植并生长。随后，将肿瘤特异性的CTL细胞通过静脉注射至携带转移灶的小鼠体内。肺转移灶的数量和大小可通过注射的肿瘤细胞数量以及肿瘤生长时间加以控制，因此可模拟从微小转移至广泛转移的各种转移阶段。肺转移灶通过墨汁灌注进行分析，从而便于肉眼观察和定量评估。

方案

1. 实验性转移小鼠模型

1. 在接种肿瘤细胞的前一天，将最多 1 × 10⁷ 个 CMS4-Met 细胞接种于一个 T75 培养瓶中，加入 10 mL 含 10% 血清的 RPMI 培养基，以获得快速生长的肿瘤细胞。在 37°C 下孵育过夜。
2. 在接种当天，吸除培养基，用 PBS 洗涤细胞一次，然后在 37°C 下使用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 消化 5 分钟以收获肿瘤细胞。加入 10 mL 含 10% 血清的 RPMI 培养基终止反应。将细胞转移至锥形管中。
3. 在室温下，使用 Sorvall Legend RT 离心机以 1300 rpm 离心 3 分钟，收集细胞。弃去上清液。用 10 mL 新鲜的 1× HBSS 重悬细胞进行洗涤，再次离心，并以相同方式重悬细胞。
4. 使用血细胞计数板对肿瘤细胞进行计数。用 HBSS 稀释细胞，使每次注射所需的细胞重悬于总体积为 100 μL 的溶液中。
5. 将 6–8 周龄的 BALB/c 小鼠置于盛有温水的烧杯中加温，以扩张尾静脉。将小鼠固定在实验台上的尾静脉固定装置中。使用微量注射器向侧尾静脉注射 100 μL 肿瘤细胞悬液。采用无菌操作技术以避免感染。注射后，对注射部位施加轻微压力，直至出血停止。
6. 将小鼠放回笼中，使其肿瘤生长至所需阶段。

2. 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）过继性转移免疫治疗

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
溶液：
印度墨水溶液（17）：
将150 ml蒸馏水倒入250 ml的烧瓶中。 向蒸馏水中加入4滴氢氧化铵。 向氨水混合液中加入30 ml印度墨水储备液（即 Sanford Black Magic 防水绘图墨水 4465 型号 44011）。 用蒸馏水定容至200 ml。溶液即可用于注射。
Fekete 溶液（17）：
Fekete 溶液用于漂白注入印度墨水的荷瘤肺组织，以区分白色肿瘤结节与正常组织的黑色背景。
将350 ml 95%乙醇加入1 L玻璃瓶中。 加入150 ml蒸馏水 加入50 ml甲醛 加入25 ml冰醋酸