我们展示了如何使用基因枪将荧光染料（如 DiI）导入不同年龄的啮齿类动物和非人灵长类动物脑切片中的神经元。在本实验中，我们使用成年小鼠（3-6 月龄）和成年食蟹猴（9-15 岁）。该技术最初由 Lichtman 博士实验室描述（Gan et al., 2000），非常适合用于研究树突分支及树突棘形态，且可在使用低浓度去污剂的条件下与传统的免疫染色结合使用。
本文内容
摘要
摘要
DiOLISTIC 染色法利用基因枪将荧光染料（如 DiI）导入脑切片中的神经元（Gan et al., 2009；O'Brien 和 Lummis, 2007；Gan et al., 2000）。本文详细描述了该技术所需的每一步操作，并提供了成功与失败结果的示例图像，以帮助实验人员建立该方法。根据我们的经验，DiOLISTIC 技术成功应用的关键在于几个步骤：DiI 包被子弹的质量、固定剂暴露的程度，以及孵育溶液中所用去垢剂的浓度。本文还提供了常见问题的解决建议与方案。
这是一种通用的标记技术，可应用于多种动物物种，并适用于广泛的年龄阶段。与其他荧光标记技术不同，后者通常仅限于来自幼龄动物的样本或仅适用于小鼠，因为它们依赖于荧光转基因的表达；而DiOLISTIC标记技术可用于所有年龄、物种和基因型的动物，并且可与免疫染色联合使用，以鉴定特定的细胞亚群。本文中，我们展示了利用DiOLISTIC技术对成年小鼠和成年非人灵长类动物脑切片中的神经元进行标记，旨在定量分析树突分支及树突棘的形态。
方案
1. 准备DiI/钨珠子弹：应在切取脑片之前提前制备DiI（1-1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲碳菁高氯酸盐）子弹。具体操作耗时约2–4小时，取决于一次性制备的子弹数量。
- 若从新的一批钨珠开始操作，需准备每份300 mg的分装样品。分装方法如下：将6克钨珠悬浮于2 ml二氯甲烷中，然后用移液器吸取100 μl珠液分装至微量离心管中，得到每份含300 mg钨珠的样品。将分装样品于室温下储存。（注意：二氯甲烷挥发极快。也可使用酒精以减少挥发）。
- 当从分装的钨珠开始操作时，将每份样品（300 mg钨珠）重悬于300 μl二氯甲烷中，并迅速盖上盖子以防止溶剂挥发。此体积足够制备3批基因枪微粒。
- 通过称取13.5 mg亲脂性染料DiI，并加入450 μl二氯甲烷（终浓度 = 3 mg/100 μl）来配制染料溶液。
- 对钨珠进行染料包被。将一张载玻片置于涂蜡的称量纸上，用移液器将100 μl钨珠悬液加至载玻片表面。加入100 μl DiI溶液，用移液器吸头充分混匀，然后在空气中干燥至钨珠变为浅灰色。
- 使用剃刀刀片将载玻片上的钨珠刮下，并将聚集的珠体切碎成细粉。（注意：若需制备多种颜色的基因枪微粒，应使用新刀片以避免染料交叉污染）。
- 将切碎的钨珠刮至称量纸上，通过漏斗转移至15 ml锥形管中。加入3 ml水，在室温下于水浴中超声处理10–30分钟。（注意：切碎粉末和超声处理的目的是尽量减少包被钨珠的团聚，从而避免干扰单个神经元的稀疏标记）。
2. 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液与导管的准备： 为提高微珠在弹丸管（TEZFEL管）上的附着性，可用聚乙烯吡咯烷酮对管壁进行包被 (PVP）溶液。
- 配制10 mg PVP/ml的PVP水溶液10 ml。
- 使用带有管路接头（内径略大的柔性管）的12 ml注射器，将PVP溶液经子弹状管路通过后从另一端排出。若同时制备多批样品，可重复使用该溶液以涂覆更多子弹状管路。使用后弃去PVP溶液。
- 向子弹状管路中加入微珠前，先涡旋混匀微珠使其形成均匀悬液，再用注射器将微珠悬液抽吸通过管路，使微珠在管路中均匀分布。（注意： 尽量减少管路中的气泡数量）。
- 将管路穿过制备工作站，静置使微珠沉降。用注射器轻轻吸除水分，仅保留微珠。
- 在制备工作站中旋转管路，并用氮气吹干，直至肉眼不可见水滴。此步骤约需10–20分钟。
- 用管路切割器将管路切成13 mm长的片段，放入含有Drierite或其他类型无水硫酸钙的闪烁瓶中。用铝箔包裹瓶体以避光保存。
3. DiI 染色：该标记技术可用于对来自不同物种的脑组织中的神经元进行染色；在此特定情况下，来源于小鼠（3-6 月龄）和非人灵长类动物（9-15 岁）。
最好使用经心脏灌注固定液后获取的固定脑组织来制备切片，因为在此条件下组织保存效果最佳。然而，并非总能实现灌注固定（如猴组织即属此情况），而DiOLISTIC标记仍可在不同的组织制备方法下成功应用。本文将介绍三种不同的组织制备方法：
- 通过心脏灌注固定脑组织 → 取出脑组织 → 后固定10分钟 → 切片 → 染色
- 取出脑组织 → 切取组织块 → 固定组织块 → PBS缓冲液洗涤 → 切片 → 染色
- 取出脑组织 → 切片 → 固定 → 洗涤 → 染色
在本研究中，猴脑组织取自经心脏灌注冰冻人工脑脊液（ACSF）后获取脑组织的实验动物，包含尾状核和壳核的组织块（厚约4 mm）在室温下固定60分钟。所有固定步骤均使用含4%多聚甲醛和4%蔗糖的PBS溶液（新鲜配制或在15天内使用）。需要注意的是，固定时间对染色结果至关重要。过度固定可能破坏细胞质膜的完整性，导致染料从细胞中泄漏（详见结果部分的说明）。
- 用于操作步骤 a 和 b，切片（200μm) 从固定的脑组织或组织块上切下，切片置于含 PBS 的 24 孔板中。操作步骤 c，新鲜的急性脑切片（200 μm) 在含有（单位：mM）110 Choline-Cl、25 NaHCO₃ 的冰冷切割液中用振动切片机进行切片3，1.25 NaH2PO4，2.5 KCl，0.5 CaCl2 ，7 MgCl2，25 葡萄糖，11.6 抗坏血酸，3.1 丙酮酸（渗透压 = 310 mOsmols），切片放入 24 孔板后立即在室温下用固定液固定 30 分钟。
- 用 PBS 清洗切片，共 3 次。
- 在拍摄切片前，移除孔中的PBS，并使用画笔将切片置于孔的中央。
- 将DiI标记的子弹射入植株 3.0 μm 使用Helios基因枪系统，在枪口与样品之间距离为1.5 cm的条件下，以120–180 psi的氦气压力将滤纸轰击。
(重要提示：该方法仅能标记切片表面50 mm范围内的神经元，因此在洗涤和封片过程中保持切片同一侧朝上至关重要。通过这种方式，可确保成像时被标记的神经元位于共聚焦显微镜的焦距范围内。 - 用 PBS 清洗切片 3 次，并将其置于 PBS 中保存数小时，以使 DiI 沿树突扩散。
- 将切片用 ProLong Gold Antifade 封片剂置于载玻片上，并用 18×18 mm 盖玻片（No.1）封片。注意： 对于步骤c，最好在切片制备的当天进行装片，因为切片的完整性在过夜后难以良好维持。).
- 封片介质干燥后，用透明指甲油封固。
- 或者，可在封片前按照下述方法用抗体对切片进行染色。
(注意： 载玻片若避光保存，可使用至少6个月至1年 4°CDiI 对光敏感，长期暴露于光线下会导致染料褪色).
4. 抗体染色： 免疫染色应在步骤 3.4 之后、封片之前进行。
- 通透化： 将切片在含有 0.01% Triton X-100 的 PBS 溶液中室温孵育 15 分钟（每孔 300–500 μl）。
注意： 避免使用更高浓度的去污剂，否则会溶解 DiI 并显著降低荧光染色强度。应尽量缩短在去污剂中的处理时间，长时间孵育也会减弱 DiI 标记效果。如需延长孵育时间，应将切片保存在 PBS 中而非封闭液中。 - 封闭： 将切片在封闭液（含 10% 山羊血清、0.01% Triton X-100 的 PBS）中室温孵育 30 分钟。
- 一抗孵育： 将一抗按所需稀释比例加入封闭液中（例如兔抗 GFP 抗体按 1:1000 稀释），每孔加入 300–500 μl，孵育 1–2 小时。注意： 若需过夜孵育，应从封闭液中去除去污剂。
- 用 PBS 洗涤切片，每次 5–15 分钟，共洗涤 3 次。
- 二抗孵育： 在室温下用二抗孵育 30 分钟。将二抗按所需稀释比例用封闭液配制（例如 Alexa-Fluor 488 标记的二抗按 1:1000 稀释）。
- 用 PBS 洗涤切片，每次 5–15 分钟，共洗涤 4 次。
- 将切片用 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂封固于载玻片上，并加盖 18×18 mm 的 1 号盖玻片。待封片剂干燥后，用指甲油封边。
5. 代表性结果：
- 检查标记是否正确：可通过配备汞灯和红色荧光滤光片组的荧光解剖显微镜观察切片，以确认DiOLISTIC标记是否成功。图1展示了在低倍镜下获得的标记效果良好的脑切片代表性图像。需注意两个重要特征：稀疏的标记模式（图1A），以及能够分辨单个细胞结构（图1B-C）。
- DiOLISTIC标记问题排查：图2展示了DiOLISTIC标记失败的切片示例。根据我们的经验，标记效率低下的主要原因有以下三种：
- 标记过稀或过密：某些切片中标记的细胞数量极少，而另一些则过多，导致无法分离和研究单个细胞成分。解决方案：调整用于包被TEFZEL子弹管的最终溶液中包被微珠的浓度（见步骤1.6）。为纠正标记过稀或过密的情况，可分别减少或增加溶解微珠所用水的体积（初始值为3 ml）。此外，标记效率低下也可能由轰击包被微珠时气体压力未达最佳水平所致。可通过检查TEFZEL子弹管在轰击后是否已释放大部分包被微珠且管体变得透明，来排除此可能性；否则应提高轰击时的气体压力。
- 子弹质量差：在制备子弹过程中，染料包被的钨微珠形成大块团聚物或簇状结构。切片图像将类似于图2A-B所示示例。解决方案：重新制备子弹，特别注意步骤1.5的操作，和/或延长步骤1.6中的超声处理时间。
- 过度固定：组织在多聚甲醛溶液中固定时间超过最佳所需时长（200–300 μm切片为30分钟，4 mm切片为1小时）。这会破坏细胞膜完整性，导致染料从细胞中扩散，使标记切片呈现图2C-D所示的失焦样外观。解决方案：缩短固定时间。
- 共聚焦成像：使用共聚焦显微镜（Zeiss LSM 510 META）获取图像堆栈，其中全细胞成像采用20倍物镜，树突片段成像采用63倍水浸物镜。DiI使用561 nm DPS激光激发，而二抗产生的绿色荧光则使用488 nm激光激发。共聚焦显微镜的光学切片能力可进一步实现对样品中单个标记细胞的精确分离。图3A显示了来自小鼠脑的纹状体中型棘状神经元及其复杂的树突分支模式。啮齿类动物（图3B）和非人灵长类动物（图3C）神经元树突分支的高倍镜图像，展示了该技术在这两个物种中对树突及树突棘的染色程度。即使是在中型棘状神经元中极为丰富的细长树突棘头部，其形态也清晰可辨。
当DiOLISTIC与免疫染色联合使用时，共聚焦成像还有助于明确将染色信号定位至同一焦平面和同一细胞。图4展示了一个单细胞中DiI标记与GFP免疫染色共定位的示例。该图像来自一个转基因小鼠纹状体切片的单个图像堆栈（z轴层厚0.7 μm），该小鼠在D1多巴胺受体启动子驱动下表达荧光蛋白GFP。
图1. 非人灵长类动物脑切片中神经元的DiI标记。(A) 来自食蟹猴的包含尾状核的染色脑切片低倍图像，显示神经元被DiI稀疏标记。 (B-C) 可使用荧光解剖显微镜轻松识别分离的中型棘状神经元。
图 2. DiOLISTIC 标记技术的故障排除。（A-B） 猴子（A）和小鼠（B）背侧纹状体的染色切片，显示大量染料包被的微珠聚集成团，导致无法分辨单个细胞结构。（C-D） 对长期保存在固定液中或组织保存失败的猴子（C）和小鼠（D）脑组织切片进行 DiOLISTIC 标记所得到的结果示例。
图 3. 用 DiI 染色的纹状体中等棘状神经元的共聚焦图像。（A） 完整细胞的图像堆栈可用于树突分支的形态学分析。（B-C） 来自小鼠（B）和猴（C）中等棘状神经元的树突片段清晰显示树突和突触棘的标记。
图4. DiOLISTIC标记与免疫染色的结合。（A） DiI 标记 表达绿色荧光蛋白（GFP）的BAC转基因小鼠纹状体中等棘状神经元，该蛋白在D1多巴胺受体启动子驱动下表达。 （B） 使用抗GFP抗体进行免疫染色，方法参照Lee et al.（2006）的方案改良。与A图相同视野。 (C) 红绿荧光叠加图像显示DiI标记的神经元为GFP阳性神经元。
讨论
DiOLISTIC 标记法是一种可用于荧光标记细胞的多功能技术，因其可应用于来自不同物种的组织切片、适用于多种年龄阶段，并可用于新鲜组织或经固定灌注动物获取的组织（另见 Gan et al., 2009）。该方法操作相对快速，仅需 1 至 2 天，且可与其他经典标记方法（如免疫染色）联合使用（Lee et al., 2006）。在操作中应特别注意避免过度固定，以及避免在孵育溶液中使用高浓度去污剂，因为这些因素会破坏脂质膜的完整性，导致染料从细胞中泄漏。抗体的渗透可通过在孵育溶液中添加低浓度的 Triton X-100（Lee et al., 2006）、毛地黄皂苷（digitonin）或皂苷（saponin）来促进（Matsubayashi et al., 2008）。该技术可进行若干改进，例如使用携带多种染料的微弹（Gan et al., 2000 所述），或调整抗体孵育的时间和类型（Neely et al., 2009）。
传统上，DiI 被用于示踪脑内的神经元投射。DiOLISTIC 标记技术进一步拓展了其应用范围，提供了一种可用于研究细胞形态的方法。神经元形态备受关注，原因在于脑内存在高度的形态多样性，且人们推测细胞形状可能反映了神经系统中神经元群体功能的多样性。其中一个例证是，哺乳动物神经系统中的许多神经元具有称为树突棘的小型突起，而这些结构正是谷氨酸能突触的发生部位。因此，可通过本文所述的标记技术测量树突棘的密度，并将其与细胞上谷氨酸能突触的密度相关联。此外，还可对其他形态学参数进行定量分析与研究，例如树突总长度、分支模式、树突棘的形态和密度等。
与依赖明场显微镜的传统技术（例如高尔基染色）相比，使用荧光标记研究神经元形态具有诸多优势，因为它能够实现更高分辨率的共聚焦成像。在旨在测量树突棘密度和形态的实验中，使用DiI作为荧光染料的另一优势在于其亲脂性特性。DiI可嵌入质膜中，清晰地勾勒出神经元突起和树突突起的轮廓。鉴于大多数树突棘体积微小（小于1飞升），膜染色比细胞质染色更高效，能更清晰地显示细小、纤薄的突起结构。
披露
所有动物实验均遵循美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所动物护理与使用委员会以及俄勒冈国家灵长类动物研究中心的指导进行。作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Michael Feyder 和 Terrell Holloway 在本技术初始建立过程中提供的帮助，以及 Fumi Ono 博士实验室为我们提供共聚焦显微镜的使用机会。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）通过 NIAAA 和 NINDS 的院内研究项目资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-1’-二十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基-吲哚羰花青高氯酸盐（DiI） | Invitrogen | D-282 | |
| 二氯甲烷 | Mallinckrodt Baker Inc. | H485-06 | |
| 钨珠 | Bio-Rad | 165-2269 | 1.7 μm 直径 |
| 聚乙烯吡咯烷酮 | Calbiochem | 529504 | |
| Tefzel 弹头套管 | Bio-Rad | 165-2441 | |
| 套管切割器 | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios 基因枪 | Bio-Rad | 165-2431 | |
| Isopore 膜滤纸 | EMD Millipore | TSTP02500 | 3.0 μm 孔径 |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36930 | |
| 多聚甲醛 | Alfa Aesar | 30525-89-4 | (16% w/v) |
参考文献
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).
- Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes. Methods. 30, 79-85 (2003).
- Lee, K. W., Kim, Y., Kim, A. M., Helmin, K., Nairn, A. C., Greengard, P. Cocaine-induced dendritic spine formation in D1 and D2 dopamine receptor-containing medium spiny neurons in nucleus accumbens. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 3399-3404 (2006).
- Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin. J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).
- Neely, S. tanwood, Deutch, G. D., Y, A. Combination of diOlistic labeling with retrograde tract tracing and immunohistochemistry. J Neurosci Methods. 184, 332-336 (2009).
- O'Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun. Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).
- Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats. J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).
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