大鼠坐骨神经轴浆的分离

摘要

我们展示了一种从成年大鼠坐骨神经中分离轴浆的方案，该方法基于神经束的解剖以及在低渗培养基中孵育，以释放髓鞘并裂解非轴突结构，随后提取剩余的富含轴突的物质。

摘要

从周围神经中分离纯化的轴突胞质（轴浆）对于研究多种生物学过程的生化分析至关重要。本文中，我们演示并描述了一种从成年大鼠坐骨神经中分离轴浆的实验方案，该方案基于以下步骤：（1）解剖神经束并分离结缔组织；（2）将神经束的短段在低渗介质中孵育，以释放髓鞘并裂解非轴突结构；（3）提取剩余的富含轴突的物质。对该制备物的蛋白质组学和生化表征已证实其对轴突组分具有高度富集。

方案

本方案可实现轴浆的分离，同时最大限度减少胶质细胞和血管组织的污染。该方法每次可从一只8至10周龄的Wistar大鼠中获得约70-100 μg的总轴浆蛋白。

1. 解剖坐骨神经

1. 通过吸入 CO₂ 并随后进行颈椎脱位的方法处死两只大鼠。在开始解剖前，通过触诊确认无心跳以验证动物死亡。
2. 用 70% 乙醇擦拭解剖区域。
3. 剪开皮肤，小心使用剪刀和镊子分离肌肉并分离坐骨神经，避免损伤血管。从每只动物中分离双侧坐骨神经（每根约 1.5 cm），并将四根神经全部收集至一个离心管中，加入 500 μL 0.2X PBS + 抑制剂，并置于冰上保存。
4. 将神经段转移至含有至少 2 mL 0.2X PBS + 蛋白酶抑制剂的塑料培养皿中。
5. 在双目显微镜下使用精细镊子去除神经的外膜。极其小心地分离神经束，直至其变得浑浊并开始漂浮于溶液表面。此步骤需反复练习，以确保能够快速而准确地完成（每根神经不超过 10 分钟）。

2. 孵育、洗涤与洗脱

1. 将分离的神经束转移至含有500 μL含蛋白酶抑制剂的0.2X PBS的离心管中，在室温下孵育2小时。
2. 用1 mL相同缓冲液至少洗涤3次，每次将神经束从一个离心管转移至另一个离心管，并在转移后振荡5分钟。
3. 为去除多余液体，先将神经束放入一个新的空离心管中，然后将其转移至含有300 μL含蛋白酶抑制剂的1X PBS的新的离心管中，在室温下孵育20–30分钟。
4. 在4°C下以10,000 × g离心10分钟。
5. 收集上清液并测定蛋白浓度。此即为轴浆制备物。

3. 代表性结果

图1. 使用手动挤压法分离的轴浆与本方案所述方法分离的轴浆样品的Western印迹比较。 可见白蛋白和GFAP水平显著降低，分别代表血液蛋白和胶质细胞污染减少。相反，轴突特异性蛋白Tubulin β3在此样品中富集，表明轴突蛋白纯度较高。

讨论

生化与蛋白质组学分析已证实，与先前报道的通过机械挤压法分离轴浆的方法¹相比，该操作可减少血清和胶质细胞的污染³。我们已采用此轴浆分离方案研究坐骨神经损伤后驱动蛋白介导的逆行信号传导²，并预期其在探索成年外周神经中许多其他过程（包括轴突-胶质细胞相互作用⁴）方面具有广泛应用价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
雄性Wistar大鼠（8-10周龄） 含蛋白酶抑制剂（Roshe）的PBS 0.2X和PBS 1X溶液（每50 ml加2片） 1.5 ml离心管 35 mm无菌塑料培养皿 解剖工具，包括：剪刀和精细镊子 双目显微镜及台灯
抗体
小鼠抗GFAP单克隆抗体G-A-5购自Sigma公司（货号G6171）。兔抗白蛋白抗体购自Cedarlane公司（货号CLAG5140）。小鼠抗微管蛋白β3抗体和兔抗gERK抗体均购自Sigma公司（货号分别为T2200和M5670）。