弓形虫（Toxoplasma gondii）在应对环境应激时会转化为包囊形式，该过程可在组织培养模型中模拟。本视频展示了通过激活骨髓来源的巨噬细胞或改变成纤维细胞培养基的pH值来诱导包囊壁形成的实验技术。
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摘要
摘要
Toxoplasma gondii 是一种专性胞内寄生虫，能够侵入任何温血动物的有核细胞。在感染过程中，T. gondii 以快速增殖的形式——速殖子——进行播散。速殖子通过一种尚未充分阐明的信号通路转化为缓慢生长的包囊形式，即缓殖子。在动物体内，缓殖子包囊主要存在于中枢神经系统和肌肉组织中，代表感染的慢性阶段。在体外培养中，可通过 CO2 饥饿、使用高 pH 培养基或添加干扰素 γ（IFNγ）来模拟向缓殖子的转化。缓殖子的特征之一是具有包囊壁，该结构可与植物凝集素 Dolichos biflorus 凝集素（DBA）结合。荧光标记的 DBA 可用于观察在人包皮成纤维细胞（HFFs）中生长的寄生虫的包囊壁，这些细胞被置于低 CO2 和高 pH 培养基中。同样，在经 IFNγ 和脂多糖（LPS）激活的小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMMs）中寄生的虫体，其包囊壁也可通过 DBA 检测到。本实验方案将演示如何通过使用低 CO2 和高 pH 培养基诱导 T. gondii 转化为缓殖子，并通过激活 BMMs 促进该过程。宿主细胞将被培养在盖玻片上，接种速殖子后，分别加入 IFNγ 和 LPS（BMMs）或置于高 pH 培养基（HFFs）中培养三天。感染完成后，宿主细胞将被固定、通透化并封闭。利用罗丹明标记的 DBA 通过荧光显微镜观察包囊壁。
方案
1. 人包皮成纤维细胞（HFF）包被盖玻片的制备
- 将无菌圆形玻璃盖玻片放置于24孔细胞培养板各孔底部。
- 从融合的150 cm2 培养瓶中收集人包皮成纤维细胞（HFFs）时，用1× PBS冲洗培养瓶两次，加入2.5 ml 0.025%胰蛋白酶-EDTA，于37°C孵育5–10分钟。
- 轻轻敲击培养瓶侧面，使其贴壁细胞脱落。待细胞完全脱落之后，加入150 ml HFF培养基（含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基），并用该培养基冲洗培养瓶以收集细胞悬液。
- 将1 ml细胞悬液分别加入含盖玻片的各孔中。
- 将细胞置于37°C、5% CO2 条件下培养至完全融合。
2. 准备用于 BMC 发育的 L929 条件培养基（CM）
- L929 是一种小鼠非整倍体纤维肉瘤细胞系，在达到完全汇合后长期培养可分泌巨噬细胞集落刺激因子。这种分泌特性使得 L929 细胞的条件培养基（CM）可用于在细胞培养中诱导小鼠骨髓细胞分化为巨噬细胞1。
- 待 L929 细胞达到汇合后，继续培养 7–9 天，直至细胞呈圆形并开始从培养瓶表面脱落。收集上清液，并在 425 × g 离心 10 分钟以沉淀脱落的细胞。此上清液即为条件培养基（CM）。
- 一个 150 cm2 培养瓶的 L929 细胞可产生 30 ml 条件培养基（CM），用于制备 150 ml 骨髓细胞（BMC）培养基。BMC 培养基由 DMEM 培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、20% 条件培养基（CM）、1% 青霉素-链霉素和 1% L-谷氨酰胺组成。
3. 骨髓分离与骨髓细胞的细胞培养
- 通过 CO 处死一只 C57BL/6 小鼠2 窒息后用70%乙醇表面消毒。
- 通过提起靠近腿部的腹部皮肤并用剪刀剪开，暴露腹膜。注意避免刺破腹膜腔。沿腿部向下剪开，暴露胫骨和股骨。用剪刀剪除腿部骨骼上的肌肉组织。
- 为取下股骨，在膝关节下方和髋关节附近各切割一次。将骨骼置于含有冷的1×PBS的细菌培养用培养皿中。这些步骤中切勿使用组织培养处理过的培养皿，因为骨髓细胞（BMCs）会永久黏附。使用解剖刀刮除多余的肌肉组织。在膝关节上方稍作切割以暴露骨髓。
- 重复步骤 (b) 和 (c)，以采集第二根股骨中的骨髓。
- 使用装有冷的1×PBS的10 ml注射器和25号针头，将骨髓冲入50 ml锥形管中。骨髓完全移除后，骨骼应呈现纯白色。
- 将PBS/骨髓混合液通过22号针头，以分散任何骨髓团块。
- 以 425 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。
- 将沉淀重悬于8 ml BMC培养基中。取1 ml细胞悬液与9 ml BMC培养基加入8个细菌学培养皿中。
- 孵育于 37°C，5% CO₂2.
- 第5天，向每块培养板中加入10 ml BMC培养基。至第7天，细胞将完全发育。成熟后的BMC可传代培养1-2周。
- 为分离BMCs，移除培养基并向每个培养皿中加入5 ml预冷的1X PBS。孵育于 4°C 孵育30分钟，直至细胞开始脱落。用无菌移液管将骨髓细胞从培养板上冲洗下来。
- 将BMCs收集至50 ml锥形管中，425 × g离心10分钟以形成沉淀。
- 将沉淀重悬于10 ml BMC培养基中，用血细胞计数板计数。在底部放置圆形玻璃盖玻片的24孔板中，每孔接种2×10⁵个BMC细胞。于感染前让BMC细胞贴壁过夜。 T. gondii 多余的BMC可重新接种于培养皿中以备后续使用。
4. 用T. gondii感染细胞
- 用 2×106 个 T. gondii 感染一个 25 cm2 的融合 HFF 培养瓶，并培养至细胞开始裂解（约 2–3 天）。
- 使用细胞刮刀从组织培养瓶中刮下被感染的宿主细胞单层，然后将脱落的单层细胞通过 27 号针头反复推注，以释放宿主细胞内的寄生虫。
- 使用血细胞计数板确定培养基中寄生虫的数量。
- 每孔接种 105 个寄生虫，感染来自方案 1 的 HFF 单层细胞（带盖玻片）或来自方案 3 的 BMCs。在 37°C、5% CO2 条件下孵育 3 小时，使寄生虫侵入细胞。
5. 通过环境胁迫诱导T. gondii 慢殖子发育
- 在HFF细胞中通过提高培养基pH值并剥夺CO2诱导缓殖子发育
- 准备发育培养基。发育培养基包含无碳酸氢盐的RPMI 1640培养基、1% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素和42 mM HEPES。调节pH至8.0，并过滤除菌。
- 移除感染的HFF细胞中的DMEM培养基，用1× PBS洗涤一次，然后加入1 ml发育培养基。
- 在37°C、常压空气条件下孵育3天。
- 骨髓来源巨噬细胞（BMCs）的激活
- 准备用于激活BMCs的培养基。激活培养基为BMC培养基中添加100 U/ml IFN-γ和100 ng/ml LPS。使用前将LPS在水浴中超声处理2分钟，以破坏其聚集体。
- 移除孔板中的BMC培养基，更换为1 ml激活培养基。
- 在37°C、5% CO2条件下孵育3天。
6. 免疫荧光检测
- 用 1X PBS 将感染的孔洗涤三次。
- 加入 200 μl 3% 多聚甲醛固定单层细胞，作用 20 分钟。
- 移除固定液，并用 1X PBS 洗涤孔。
- 向孔中加入 200 μl 0.1 M 甘氨酸，静置 5 分钟。
- 移除甘氨酸溶液，并用 1X PBS 洗涤孔。
- 加入 250 μl 含 3% BSA 和 0.2% Triton X-100 的 1X PBS 溶液，以透化并封闭单层细胞，作用 30 分钟。
- 移除封闭液，并用 1X PBS 洗涤孔。
- 加入 50 μl 刀豆素 Dolichos biflorus 凝集素（以含 3% BSA 和 0.2% Triton X-100 的 1X PBS 溶液按 1:250 稀释）。
- 盖好培养板，置于平台摇床上，室温孵育 1 小时。
- 在平台摇床上用含 0.2% Triton X-100 的 1X PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
- 使用含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的 VectaShield 封片剂封片。
- 使用荧光显微镜，在罗丹明滤光片下以 100 倍放大倍数观察染色的 T. gondii。
7. 代表性结果
图1显示了在pH应激条件下，T. gondii在活化的BMM和HFF中典型的DBA染色结果。两者均在含寄生虫空泡周围显示出DBA染色，表明存在包囊壁成分。活化BMM的图像显示DBA染色与空泡表面一致。在pH应激的HFF中，T. gondii的横切面显示包囊壁被染色，而内部结构未见染色。
图1. 应激条件下T. gondii的DBA染色。 处于应激条件下的胞内寄生虫，包括活化的BMMs或pH应激的HFFs，使用罗丹明标记的DBA（红色）进行染色。微分干涉相差（DIC）图像显示了包囊的轮廓，黑色标尺代表2 μM。
动物实验
动物实验按照威斯康星大学动物护理与使用委员会制定的指南和规定进行。
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讨论
尽管缓殖子发育的机制尚未完全阐明，但对T. gondii在组织培养中阶段转化的分子遗传学分析已促使人们发现了参与缓殖子包囊形成的基因2,3,4。这些分析还发现，在其他长期应激条件下，部分缓殖子标志物也会表达，例如在活化的巨噬细胞中生长时5,6。上述方法描述了如何在骨髓来源的巨噬细胞（BMCs）和人包皮成纤维细胞（HFFs）中培养T. gondii，并诱导产生DBA阳性的包囊壁结构。这些结果表明，不同的应激刺激均可诱导包囊发育通路的激活。
由于T. gondii几乎可以在所有温血宿主的有核细胞中生长，因此多种细胞类型均可用于体外培养T. gondii。本实验方案选用HFFs，因为它们是一种具有接触抑制特性的细胞系。由于细胞培养条件下缓殖子的发育需要三天时间，使用不会过度生长的细胞系更为方便。HFFs是原代细胞，无法无限传代。HFFs在组织培养中传代次数越多，对高pH培养基的耐受性越低，因而越不适合用于诱导缓殖子转化。为获得最佳效果，宿主细胞应选用低代次细胞，并在达到汇...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由威斯康星大学麦迪逊分校Herman I. Shapiro杰出研究生奖学金（C.M.T.）、美国国立卫生研究院资助项目AI072817（A.M.P.）以及美国心脏协会资助项目0840059N（L.J.K）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（DMEM） | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
| 胎牛血清（FBS） | Atlanta Biologicals | S11150 | 热灭活 |
| 罗丹明标记的Dolichos biflorus 凝集素 | Vector Laboratories | RL-1032 | |
| 甲醛（16%） | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| 甘氨酸 | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| IFNγ | PeproTech Inc | 315-05 | 分装保存，避免反复冻融 |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| 脂多糖（LPS） | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | 分装保存，避免反复冻融 |
| 显微镜盖玻片 | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 青霉素-链霉素 | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| RPMI 1640 培养基粉末（含 L-谷氨酰胺，不含碳酸氢盐） | GIBCO, by Life Technologies | 31800-022 | |
| 吐温-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| 含 DAPI 的 VectaShield 封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 |
参考文献
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