Toxoplasma gondii 在活化骨髓来源巨噬细胞及缓殖子条件下包囊壁的形成

摘要

弓形虫（Toxoplasma gondii）在应对环境应激时会转化为包囊形式，该过程可在组织培养模型中模拟。本视频展示了通过激活骨髓来源的巨噬细胞或改变成纤维细胞培养基的pH值来诱导包囊壁形成的实验技术。

摘要

Toxoplasma gondii 是一种专性胞内寄生虫，能够侵入任何温血动物的有核细胞。在感染过程中，T. gondii 以快速增殖的形式——速殖子——进行播散。速殖子通过一种尚未充分阐明的信号通路转化为缓慢生长的包囊形式，即缓殖子。在动物体内，缓殖子包囊主要存在于中枢神经系统和肌肉组织中，代表感染的慢性阶段。在体外培养中，可通过 CO₂ 饥饿、使用高 pH 培养基或添加干扰素 γ（IFNγ）来模拟向缓殖子的转化。缓殖子的特征之一是具有包囊壁，该结构可与植物凝集素 Dolichos biflorus 凝集素（DBA）结合。荧光标记的 DBA 可用于观察在人包皮成纤维细胞（HFFs）中生长的寄生虫的包囊壁，这些细胞被置于低 CO₂ 和高 pH 培养基中。同样，在经 IFNγ 和脂多糖（LPS）激活的小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMMs）中寄生的虫体，其包囊壁也可通过 DBA 检测到。本实验方案将演示如何通过使用低 CO₂ 和高 pH 培养基诱导 T. gondii 转化为缓殖子，并通过激活 BMMs 促进该过程。宿主细胞将被培养在盖玻片上，接种速殖子后，分别加入 IFNγ 和 LPS（BMMs）或置于高 pH 培养基（HFFs）中培养三天。感染完成后，宿主细胞将被固定、通透化并封闭。利用罗丹明标记的 DBA 通过荧光显微镜观察包囊壁。

方案

1. 人包皮成纤维细胞（HFF）包被盖玻片的制备

1. 将无菌圆形玻璃盖玻片放置于24孔细胞培养板各孔底部。
2. 从融合的150 cm² 培养瓶中收集人包皮成纤维细胞（HFFs）时，用1× PBS冲洗培养瓶两次，加入2.5 ml 0.025%胰蛋白酶-EDTA，于37°C孵育5–10分钟。
3. 轻轻敲击培养瓶侧面，使其贴壁细胞脱落。待细胞完全脱落之后，加入150 ml HFF培养基（含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基），并用该培养基冲洗培养瓶以收集细胞悬液。
4. 将1 ml细胞悬液分别加入含盖玻片的各孔中。
5. 将细胞置于37°C、5% CO₂ 条件下培养至完全融合。

2. 准备用于 BMC 发育的 L929 条件培养基（CM）

1. L929 是一种小鼠非整倍体纤维肉瘤细胞系，在达到完全汇合后长期培养可分泌巨噬细胞集落刺激因子。这种分泌特性使得 L929 细胞的条件培养基（CM）可用于在细胞培养中诱导小鼠骨髓细胞分化为巨噬细胞¹。
2. 待 L929 细胞达到汇合后，继续培养 7–9 天，直至细胞呈圆形并开始从培养瓶表面脱落。收集上清液，并在 425 × g 离心 10 分钟以沉淀脱落的细胞。此上清液即为条件培养基（CM）。
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讨论

尽管缓殖子发育的机制尚未完全阐明，但对T. gondii在组织培养中阶段转化的分子遗传学分析已促使人们发现了参与缓殖子包囊形成的基因^2,3,4。这些分析还发现，在其他长期应激条件下，部分缓殖子标志物也会表达，例如在活化的巨噬细胞中生长时^5,6。上述方法描述了如何在骨髓来源的巨噬细胞（BMCs）和人包皮成纤维细胞（HFFs）中培养T. gondii，并诱导产生DBA阳性的包囊壁结构。这些结果表明，不同的应激刺激均可诱导包囊发育通路的激活。

由于T. gondii几乎可以在所有温血宿主的有核细胞中生长，因此多种细胞类型均可用于体外培养T. gondii。本实验方案选用HFFs，因为它们是一种具有接触抑制特性的细胞系。由于细胞培养条件下缓殖子的发育需要三天时间，使用不会过度生长的细胞系更为方便。HFFs是原代细胞，无法无限传代。HFFs在组织培养中传代次数越多，对高pH培养基的耐受性越低，因而越不适合用于诱导缓殖子转化。为获得最佳效果，宿主细胞应选用低代次细胞，并在达到汇.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（DMEM）	GIBCO, by Life Technologies	11960-051
胎牛血清（FBS）	Atlanta Biologicals	S11150	热灭活
罗丹明标记的Dolichos biflorus 凝集素	Vector Laboratories	RL-1032
甲醛（16%）	Polysciences, Inc.	18814
甘氨酸	Fisher Scientific	BP381-5
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
IFNγ	PeproTech Inc	315-05	分装保存，避免反复冻融
L-谷氨酰胺（200 mM）	GIBCO, by Life Technologies	25030
脂多糖（LPS）	Sigma-Aldrich	L4391-1MG	分装保存，避免反复冻融
显微镜盖玻片	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
青霉素-链霉素	GIBCO, by Life Technologies	15140
RPMI 1640 培养基粉末（含 L-谷氨酰胺，不含碳酸氢盐）	GIBCO, by Life Technologies	31800-022
吐温-100	Fisher Scientific	BP151-500
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	GIBCO, by Life Technologies	25200
含 DAPI 的 VectaShield 封片剂	Vector Laboratories	H-1200