为了开发基于RNA干扰（RNAi）的疗法，研究人员提出了一种新策略——跨域RNA干扰（tkRNAi）。该技术利用非致病性细菌在靶细胞内产生并递送治疗性短发夹RNA（shRNA）。在此，tkRNAi成功应用于逆转癌细胞经典的ABCB1介导的多药耐药性（MDR）。
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摘要
摘要
RNA干扰（RNAi）是一种高效且特异抑制mRNA表达的机制。除了作为强大的实验室工具外，RNAi通路在治疗应用方面也显示出巨大潜力。在开发基于RNA干扰（RNAi）的疗法过程中，将介导RNAi的试剂递送至靶细胞是主要障碍之一。一种克服该难题的新型策略是跨域RNA干扰（tkRNAi）。该技术利用非致病性细菌（例如Escherichia coli）在靶细胞内产生并递送治疗性短发夹RNA（shRNA），从而诱导RNAi效应。第一代介导tkRNAi的载体TRIP含有噬菌体T7启动子，用于调控目标治疗性shRNA的表达。此外，TRIP还包含来自Yersinia pseudotuberculosis的Inv位点，该位点编码侵袭素（invasin），可使天然非侵袭性细菌进入表达β1-整合素的哺乳动物细胞；同时携带来自Listeria monocytogenes的HlyA基因，该基因表达李斯特菌溶血素O（listeriolysin O）。这种酶可帮助治疗性shRNA从靶细胞胞质内的内吞囊泡中逃逸。将TRIP构建体导入一种感受态的非致病性Escherichia coli菌株中，该菌株表达T7 RNA聚合酶，从而驱动T7启动子介导的shRNA合成。ABCB1（MDR1/P-糖蛋白，MDR1/P-gp）是多种RNAi策略中一个已被充分研究的癌症相关靶分子。该ABC转运蛋白作为一种药物外排泵，介导人类癌细胞中“经典”的ABCB1介导的多药耐药（MDR）表型，其特征为特定的交叉耐药模式。利用携带抗ABCB1 shRNA表达载体的E. coli处理多种表达ABCB1的MDR癌细胞后，可在癌细胞内激活RNAi通路，并显著下调编码ABCB1的mRNA及其相应的药物外排泵表达水平。因此，原始耐药癌细胞内的药物蓄积增加，MDR表型得以逆转。通过该模型，实验数据验证了tkRNAi可用于调控人类癌细胞中与癌症相关的因子（如ABCB1）的概念可行性。
方案
1) 细菌递送shRNA
- 在开始细菌培养之前，必须配制 LB 培养基和 LB 琼脂。
- 配制 LB 培养基时，称取酵母提取物（0.5 % w/v）、胰蛋白胨（1.0 % w/v）和 NaCl（0.6 % w/v），用双蒸水溶解这些成分。将配制好的溶液在高压灭菌器中灭菌，即可使用。
- 配制 LB 琼脂平板时，需在灭菌前向 LB 培养基中加入琼脂粉（1.5 % w/v）。
- 将 LB 琼脂在微波炉中加热至完全溶解。待溶液冷却至用手触摸瓶壁不烫手为止。加入卡那霉素（100 mg/ml），用于后续步骤中阳性克隆的筛选。
- 在超净工作台（无菌条件下）用移液器将 20 ml LB 琼脂溶液加入 10 cm 培养皿中，制备 LB 琼脂平板。待液体凝固后，平板即可使用，可于 4 °C 保存。
- 将编码 shRNA 的表达载体通过 CaCl2 法热激转化至感受态 E. coli ceq221 中。
- 将转化后的细菌涂布于含有 100 μg/ml 卡那霉素的 LB 琼脂平板上，盖上皿盖，用封口膜密封，并倒置于 37 °C 培养过夜。
- 用牙签挑取生长的单菌落，接种至含 100 mg/ml 卡那霉素的 7.0 ml 新鲜 LB 培养基中，建立细菌小量培养，于 37 °C、200 rpm 摇床中培养过夜。
- 取过夜培养的小量菌液，按 1:100 的比例接种至含 100 mg/ml 卡那霉素的 100 ml 新鲜 LB 培养基中，置于 1 L 三角烧瓶内，于 37 °C、200 rpm 摇床中培养过夜。
- 在 6 孔板中每孔接种 25 × 104 个细胞（接种数量取决于相应细胞系的生长速度；接种后 24 小时细胞融合度应约为 70–80 %）人胃癌细胞（EPG85-257RDB），于 37 °C、5 % CO2、水蒸气饱和的环境中培养过夜。
- 在癌细胞感染前，用分光光度计测定含有 tkRNAi 载体的 E. coli 过夜培养物的 OD600。将菌液稀释至光密度为 0.5（OD600 = 0.5 相当于 1.6 × 108 个细菌细胞/ml）。
- 在细菌共孵育前 30 分钟，将癌细胞的含胎牛血清（FCS）培养基更换为无 FCS 培养基。
- 用 1 × PBS 洗涤细菌两次，并用无血清的 Leibovitz L-15 培养基重悬并稀释。
- 按所需感染复数（MOI，即每个癌细胞对应的细菌数量）将稀释后的细菌加入癌细胞中，在 37 °C 共孵育 2 小时。
- 共孵育 2 小时后，用 1 × PBS 洗涤癌细胞两次，再用含 100 u/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素、2.5 μg/ml 两性霉素 B、150 μg/ml 庆大霉素和 100 μg/ml 卡那霉素的含血清 Leibovitz L-15 培养基洗涤一次。
- 继续将癌细胞置于 37 °C、5 % CO2、水蒸气饱和的环境中培养。
- 细菌处理的效果可通过荧光显微镜观察，在 mRNA 水平通过定量实时 RT-PCR 检测，在蛋白质水平通过 Western 印迹分析，并通过功能实验如流式细胞术（FACS）分析和细胞增殖实验进行验证。（如需要，这些步骤可进一步详细描述）。
2) 代表性结果
如果正确执行该方案，结果应与下图所示相似。
荧光显微镜
图1显示了细菌处理3小时后的人胃癌细胞（a），与未经处理的细胞（b）相对比。在处理后的细胞核周围可检测到细菌。
图1：荧光显微镜观察经细菌处理（1:500）的人胃癌细胞及未经处理的人胃癌细胞对照组，DAPI染色，DAPI带通滤光片（Λem = 640 nm），40倍物镜。
定量实时逆转录 PCR
在图2中，经治疗性细菌处理后，MDR1 mRNA的表达下调约70%（黑色条柱）。由于不存在MDR1过表达，亲本细胞被用作阳性对照。含有表达抗MDR1 shRNA质粒的257RDB p170细胞系被用作跨域RNA干扰技术与其他RNA干扰沉默策略的直接比较。未处理的MDR1过表达耐药细胞系EPG85-257RDB、用不含shRNA表达质粒的细菌处理的相同细胞系，以及用携带表达抗MRP2 shRNA质粒的治疗性细菌处理的该细胞系均被用作阳性对照。
图2：经表达抗MDR1 shRNA的治疗性 E. coli ceq221（MOI 1 : 500）处理后，通过定量实时RT-PCR检测MDR1 mRNA的表达水平。归一化处理使用持家基因醛缩酶（aldolase）。未处理的EPG85-257RDB细胞系的MDR1/醛缩酶比值设为100%。P值采用学生t检验计算（* = p<0.05，** = p<0.005，*** = p<0.001）。
Western印迹分析
图3显示，经细菌处理后，MDR1在蛋白水平也发生了下调。该图展示了药物敏感亲本细胞系（EPG85-257P）中MDR1的缺失表达、未经处理的耐药细胞系（EPG85-257RDB）中的MDR1表达，以及处理样本中的MDR1表达。可以明显观察到经细菌处理的细胞中MDR1表达显著下调。
图3：Western印迹分析。 未处理的药物敏感型EPG85-257P、未处理的药物耐药型EPG85-257RDB以及EPG85-257RDB在共孵育后的MDR1表达水平 E. coli ceq221 + p43 MDR1。一抗 C219 1:100 和抗肌动蛋白 1:5 000，二抗 抗小鼠 1:10 000。
细胞毒性检测
如图4所示的细胞毒性实验等功能分析也是跨域RNA干扰（transkingdom RNAi）是否发挥作用的指标。亲本细胞系和含有表达抗MDR1 shRNA质粒的细胞系对柔红霉素均未表现出任何耐药性。耐药细胞系EPG85-257RDB及另外两个对照组与用表达抗MDR1 shRNA的细菌处理的样本相比，耐药性无显著变化，而后者对柔红霉素的耐药性可逆转约90%。
图4： 细胞毒性检测。通过细胞存活性的细胞毒性检测确定药物特异性的IC50值。P值采用学生t检验计算（* = p<0.05，** = p<0.005，*** = p<0.001）。
蒽环类药物积累实验
根据细菌处理样品电阻降低的结果（图4），表达抗MDR1 shRNA的细胞中蒽环类药物的累积量增加了约90%（图5所示）。亲本细胞系和257RDB p170细胞系表现出强烈的柔红霉素累积，最高可达100%；而耐药变体几乎不显示任何累积。经表达抗MDR1 shRNA的细菌处理的细胞，其蒽环类药物累积量增加了90%。
图 5： 蒽环类药物积累实验。通过流式细胞术检测癌细胞在细菌处理后第6天的蒽环类药物积累量。P值采用学生t检验计算（* = p<0.05，** = p<0.005，*** = p<0.001）。
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讨论
用于感染的接种细胞数量以及相应的感染复数（MOI）在很大程度上取决于所观察的细胞系及其生长速度。为了确定最佳的接种细胞数量，强烈建议预先开展实验以测定细胞的生长速度。此外，由于细胞耐受细菌侵染而不因应激死亡的能力有限，应测试不同的MOI。目标基因下调的最佳时间点可能有所不同，因此建议在一定时间段内进行系列实验，以确定最佳实验条件。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由“联邦教研部（BMBF）”资助，项目编号为01GU0615。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂 | Biochrom AG | 214050 | |
| 两性霉素B | Biochrom AG | A2612 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | 无目录编号，需直接订购 | |
| 庆大霉素 | Biochrom AG | A2710 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen GmbH | 每毫升含5,000单位青霉素（碱基）和5,000 μg链霉素（碱基），使用青霉素G（钠盐）和硫酸链霉素溶于0.85%生理盐水中。 | |
| 氯化钠 | Merck KgaA | 1064060500 | |
| 胰蛋白胨 | Difco Laboratories | 211705 | |
| 酵母提取物 | Difco Laboratories | 212750 |
参考文献
- Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).
- Lage, H. MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance. Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).
- Lage, H. An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem. Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).
- Lage, H. Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers. Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).
- Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing. Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).
- Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi. FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).
- Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference. Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).
- Stein, U. Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA. Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).
- Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals. Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).
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