为了开发基于RNA干扰（RNAi）的疗法，研究人员提出了一种新策略——跨域RNA干扰（tkRNAi）。该技术利用非致病性细菌在靶细胞内产生并递送治疗性短发夹RNA（shRNA）。在此，tkRNAi成功应用于逆转癌细胞经典的ABCB1介导的多药耐药性（MDR）。
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摘要
摘要
RNA干扰（RNAi）是一种高效且特异抑制mRNA表达的机制。除了作为强大的实验室工具外，RNAi通路在治疗应用方面也显示出巨大潜力。在开发基于RNA干扰（RNAi）的疗法过程中，将介导RNAi的试剂递送至靶细胞是主要障碍之一。一种克服该难题的新型策略是跨域RNA干扰（tkRNAi）。该技术利用非致病性细菌（例如Escherichia coli）在靶细胞内产生并递送治疗性短发夹RNA（shRNA），从而诱导RNAi效应。第一代介导tkRNAi的载体TRIP含有噬菌体T7启动子，用于调控目标治疗性shRNA的表达。此外，TRIP还包含来自Yersinia pseudotuberculosis的Inv位点，该位点编码侵袭素（invasin），可使天然非侵袭性细菌进入表达β1-整合素的哺乳动物细胞；同时携带来自Listeria monocytogenes的HlyA基因，该基因表达李斯特菌溶血素O（listeriolysin O）。这种酶可帮助治疗性shRNA从靶细胞胞质内的内吞囊泡中逃逸。将TRIP构建体导入一种感受态的非致病性Escherichia coli菌株中，该菌株表达T7 RNA聚合酶，从而驱动T7启动子介导的shRNA合成。ABCB1（MDR1/P-糖蛋白，MDR1/P-gp）是多种RNAi策略中一个已被充分研究的癌症相关靶分子。该ABC转运蛋白作为一种药物外排泵，介导人类癌细胞中“经典”的ABCB1介导的多药耐药（MDR）表型，其特征为特定的交叉耐药模式。利用携带抗ABCB1 shRNA表达载体的E. coli处理多种表达ABCB1的MDR癌细胞后，可在癌细胞内激活RNAi通路，并显著下调编码ABCB1的mRNA及其相应的药物外排泵表达水平。因此，原始耐药癌细胞内的药物蓄积增加，MDR表型得以逆转。通过该模型，实验数据验证了tkRNAi可用于调控人类癌细胞中与癌症相关的因子（如ABCB1）的概念可行性。
方案
1) 细菌递送shRNA
- 在开始细菌培养之前，必须配制 LB 培养基和 LB 琼脂。
- 配制 LB 培养基时，称取酵母提取物（0.5 % w/v）、胰蛋白胨（1.0 % w/v）和 NaCl（0.6 % w/v），用双蒸水溶解这些成分。将配制好的溶液在高压灭菌器中灭菌，即可使用。
- 配制 LB 琼脂平板时，需在灭菌前向 LB 培养基中加入琼脂粉（1.5 % w/v）。
- 将 LB 琼脂在微波炉中加热至完全溶解。待溶液冷却至用手触摸瓶壁不烫手为止。加入卡那霉素（100 mg/ml），用于后续步骤中阳性克隆的筛选。
- 在超净工作台（无菌条件下）用移液器将 20 ml LB 琼脂溶液加入 10 cm 培养皿中，制备 LB 琼脂平板。待液体凝固后，平板即可使用，可于 4 °C 保存。
- 将编码 shRNA 的表达载体通过 CaCl2 法热激转化至感受态 E. coli ceq221 中。
- 将转化后的细菌涂布于含有 100 μg/ml 卡那霉素的 LB 琼脂平板上，盖上皿盖，用封口膜密封，并倒置于 37 °C 培养过夜。
- 用牙签挑取生长的单菌落，接种至含 100 mg/ml 卡那霉素的 7.0 ml 新鲜 LB 培养基中，建立细菌小量培养，于 37 °C、200 rpm 摇床中培养过夜。
- 取过夜培养的小量菌液，按 1:100 的....
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讨论
用于感染的接种细胞数量以及相应的感染复数（MOI）在很大程度上取决于所观察的细胞系及其生长速度。为了确定最佳的接种细胞数量，强烈建议预先开展实验以测定细胞的生长速度。此外，由于细胞耐受细菌侵染而不因应激死亡的能力有限，应测试不同的MOI。目标基因下调的最佳时间点可能有所不同，因此建议在一定时间段内进行系列实验，以确定最佳实验条件。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由“联邦教研部（BMBF）”资助，项目编号为01GU0615。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂 | Biochrom AG | 214050 | |
| 两性霉素B | Biochrom AG | A2612 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | 无目录编号，需直接订购 | |
| 庆大霉素 | Biochrom AG | A2710 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen GmbH | 每毫升含5,000单位青霉素（碱基）和5,000 μg链霉素（碱基），使用青霉素G（钠盐）和硫酸链霉素溶于0.85%生理盐水中。 | |
| 氯化钠 | Merck KgaA | 1064060500 | |
| 胰蛋白胨 | Difco Laboratories | 211705 | |
| 酵母提取物 | Difco Laboratories | 212750 |
参考文献
- Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).
- Lage, H.
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