纯化小鼠B细胞中类别转换重组的诱导与评估

摘要

抗原暴露后，活化的B细胞亚群会经历一种称为类别转换重组（CSR）的过程，以产生具有不同效应功能的抗体同种型。本报告所述方案解释了如何诱导并分析类别转换重组。 体外 用于研究B细胞功能。

摘要

体液免疫是由B细胞介导并通过抗体分泌发挥作用的免疫系统分支。B细胞活化后，免疫球蛋白基因座会经历一系列遗传学修饰，从而改变所分泌抗体的结合能力和效应功能。这一过程的核心是一个称为类别转换重组（class switch recombination, CSR）的基因组重排事件，其中默认的IgM抗体同种型被替换为IgG、IgA或IgE中的一种。每种同种型均具有独特的效应功能，因此CSR对于维持免疫应答至关重要。

免疫球蛋白基因座的多样化由活化诱导的胞苷脱氨酶（AID）介导。在线可获取描述该过程的示意图视频（http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html）。AID 的活性及类别转换重组（CSR）通路常用于评估小鼠 B 细胞功能和体液免疫。本报告中所述方案提供了一种从小鼠脾脏分离 B 细胞的方法，并随后用细菌脂多糖（LPS）刺激，以诱导向 IgG3 的类别转换（其他抗体同种型见表 1）。此外，使用荧光细胞染色染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）监测刺激后细胞的分裂过程，该过程对同种型转换至关重要^{1, 2}。

AID 的调控机制以及类别转换重组（CSR）的发生机制目前仍不明确，因此 体外 类别转换实验为在多种小鼠模型中检测这些过程提供了可靠的方法。这些实验此前已用于基因敲除小鼠的基因缺陷研究中 ³此外， 体外 B细胞的转换可在病毒转导介导的RNA敲低或转基因表达以调控基因表达后发生 ^4-6这些实验类型的数据加深了我们对小鼠中AID活性、CSR反应的解析以及抗体介导的免疫应答的理解。

方案

步骤一：通过磁珠富集法分离脾脏 B 细胞

1. 实验小鼠应选择8至12周龄，以确保免疫系统完全成熟。
2. 通过颈椎脱位处死小鼠，并将其浸入70%乙醇中。通过在腹部左侧肋缘处的皮肤和肌肉做切口，手术取出脾脏，并将其在磷酸盐缓冲液（PBS）中切成三大块。确保所有器械和试剂均为无菌。
3. 使用1 mL注射器活塞的橡胶端，轻轻将脾脏研磨通过 70 μm 将细胞滤过筛网推入PBS中。务必使用推动动作而非研磨动作，因为研磨可能导致较大细胞（如增殖中的细胞）破裂。
4. 以不超过 350 g 离心 5 分钟沉淀细胞，并用 PBS 重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板对重悬的细胞进行计数。
5. 制备1×10⁶个细胞/毫升的悬浮液⁸ 在无菌的5 mL聚苯乙烯带盖管中（每管最大体积为2 mL），用含5%正常大鼠血清的PBS重悬至细胞浓度为cells/mL。
6. 添加 50 μL 每次每毫升细胞使用 EasySep 阴性选择小鼠 B 细胞富集试剂盒中的分选混合液。用移液器吹打混匀，盖紧管盖，置于冰箱中孵育 15 分钟。
7. 添加 100 μL EasySep 生物素选择试剂盒，每毫升细胞使用一毫升试剂。用移液器吸取混合液，盖紧管盖，置于冰箱中孵育15分钟。
8. 添加 100 μL 每毫升细胞加入 EasySep 磁性纳米颗粒（确保充分混匀纳米颗粒，使溶液均匀）。用移液器加入混合液，盖紧管盖，置于冰箱中孵育 5 分钟。
9. 用 PBS 将溶液补至 2.5 mL，放入 EasySep 磁力架中静置 5 分钟。将磁力架和试管倒置，迅速将液体倒入新的聚苯乙烯试管中。切勿振荡试管，因为阴性选择的细胞会通过磁力结合在管壁上。
10. 为进一步提高细胞悬液的纯度，可将离心管再次插入磁铁中静置5分钟，然后倒入新的离心管中。此操作可能降低总体细胞回收率。
11. B细胞纯度可通过流式细胞术分析B细胞表面标志物来评估。富集后，我们 consistently 观察到纯度为 >95% B220 阳性细胞

第二步：CFSE 细胞染色

1. 将分离的细胞重悬于预热的磷酸盐缓冲液（PBS）中，PBS中添加0.1%牛血清白蛋白，细胞终浓度为每毫升1 × 10⁶个细胞。
2. 配制5 mM的CFSE储备液（用无菌二甲基亚砜稀释），每毫升细胞悬液中加入2 μL。终浓度为10 μM时，适用于原代B细胞的染色。
3. 在37°C避光孵育10分钟（注意：CFSE对光敏感，应尽可能避光保存和操作）。
4. 向细胞中加入等体积的新生牛血清，冰上孵育5分钟以终止染色反应。
5. 用培养基补满离心管（培养基配方见步骤III），在350 g条件下离心。注意：为抵消新生牛血清的黏稠性并确保细胞形成沉淀，加入的培养基体积至少应为原有体积的5倍。
6. 再用培养基洗涤细胞两次。此时细胞已准备好进行刺激处理。

第三步：使用LPS刺激细胞

1. 准备您的 体外 通过在RPMI 1640中添加10%胎牛血清制备B细胞培养基 50 μM β-巯基乙醇/
2. 通过添加LPS至终浓度 50μg/mL分装 125 μL 将刺激培养基加入至平底96孔组织培养板的每孔中。
3. 将CFSE染色的B细胞用不含LPS的培养基重悬，终浓度为3.2 x 10⁶/mL⁶ 细胞/mL。添加 125 μL 将细胞悬液加入含有刺激培养基的孔中，并用移液器轻轻吹打混匀。
4. 每个孔现在含有 4 x 10⁵ 最终LPS浓度下的细胞 25 μg/mL这能够提供最佳的细胞增殖和类别转换水平，但可根据需要对这些数值进行调整。
5. 将细胞置于培养箱中孵育 37°C 和 5% CO₂ 培养72至96小时。48小时后，在显微镜下可清晰观察到大量增殖的B细胞形成的细胞簇。

第四步：类别转换的流式细胞术分析

1. 当准备观察类别转换时，将细胞从培养条件下取出，并用1 mL染色缓冲液（含2%小牛血清的PBS）洗涤两次。
2. 为防止细胞发生非特异性抗体染色，将细胞在350 g离心以形成沉淀，随后进行孵育 100μL 含5%正常小鼠血清的染色缓冲液 1μg 每10⁶个细胞加入FcBlock，冰上孵育15分钟。细胞封闭步骤应在冰上进行。
3. 不洗涤细胞，直接加入 1μg 每10⁶ 用荧光标记的抗小鼠IgG3抗体对细胞进行染色，并将细胞置于冰上孵育30分钟。
4. 通过离心洗涤细胞两次，并重悬于 200-300 μL 加入染色缓冲液后，细胞即可用于流式细胞术检测。
5. CFSE 在 492 nm（由氩离子激光器激发）时激发效果最佳，发射波长为 517 nm。IgG3 抗体的激发和发射光谱取决于其偶联的荧光染料。

代表性结果

磁珠富集后，细胞悬液应呈现为均一的小型圆形细胞群体，细胞间无明显差异（图1A）。刺激48-72小时后，可见明显增大的增殖细胞形成的孤立簇状结构（图1B）。大量非增殖细胞在发生凋亡时会表现为体积较小且具有颗粒状特征。

通常在刺激后72至96小时之间，细胞存活率开始显著下降之前，可检测到最高水平的类别转换重组（CSR）⁷。在此阶段，细胞应已完成多次分裂，转换后的细胞会在后期的子代细胞群体中出现。图2展示了经LPS刺激96小时后，CFSE稀释与IgG3表面表达的代表性流式细胞术图谱。

表1. 同种型转换诱导剂混合物。注意：刺激剂浓度值仅为建议值，可能需要进行滴定优化。

目标同种型	刺激混合物
IgG1和IgE	LPS (25μg/mL) 和 IL-4 (10 ng/mL)
IgG1和IgE	Anti-CD40 (10μg/mL) 和 IL-4 (10 ng/mL)
IgG2a	LPS (25μg/mL) 和 IFN-γ (10 ng/mL)
IgG2b 和 IgG3	LPS (25μg/mL)
IgA	LPS (25μg/mL)、TGF-β (2 ng/mL) 和 IL-5 (1.5 ng/mL)

图 1. 脾脏 B 细胞的分离及 LPS 刺激。（a）LPS 刺激前经磁珠富集的脾脏 B 细胞。（b）用 25 μg/mL LPS 刺激 48 小时后。增殖的细胞表现为大量细胞簇，背景中可见正在活化增大的细胞和凋亡细胞。

图2. 培养96小时后的细胞增殖与类别转换重组。（a）经LPS刺激的细胞在培养96小时后的CFSE稀释情况。每一个独立的峰代表CFSE荧光的一次稀释，对应一次独立的细胞分裂。（b）IgG3表达情况，显示经过多轮细胞分裂后出现IgG3阳性细胞群体。

讨论

上述方案提供了一种标准检测方法，用于分析初级小鼠B细胞类别转换过程中AID的表达与功能。该方案使用细菌脂多糖（LPS）诱导从IgM向IgG3的类别转换，但可通过修改刺激培养基以诱导向其他同种型的转换（详见表1^{8, 9}）。

我们注意到，出于目前尚不清楚的原因，胎牛血清可能影响体外观察到的类别转换重组水平。为确保实验的一致性，所有类别转换重组实验必须使用同一批号的胎牛血清。此外，筛选多个来源的胎牛血清批次可能有助于获得最佳实验效果 体外 转换率。小鼠品系也可能影响类别转换的程度 体外 ¹⁰根据具体检测方法的不同，对于免疫球蛋白类型转换较差的小鼠模型（如SJL小鼠），必须将其充分回交至C57BL/6背景，以获得可观的类型转换率。

如果不需要获得纯化的B细胞培养物，可省略步骤I。对脾细胞混合物进行刺激仍可诱导类别转换，但可能导致更多非B细胞发生凋亡。此外，后续流式细胞术分析必须包含已确立的B细胞标记物（例如B220、CD19）。本实验方案所用的纯化试剂...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液	GIBCO, by Life Technologies	14190
EasySep 小鼠 B 细胞富集试剂盒	Stem Cell Technologies	19754
聚苯乙烯管	BD Biosciences	352058
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7030
CellTrace CFSE 细胞增殖检测试剂盒	Invitrogen	C34554
新生牛血清	Hyclone	SH30072.03
RPMI 1640 培养基	GIBCO, by Life Technologies	11875
来自 Escherichia coli 的脂多糖	Sigma-Aldrich	L6529
β-巯基–乙醇	GIBCO, by Life Technologies	21985
胎牛血清	Hyclone	SH30396.03
正常小鼠血清	Jackson ImmunoResearch	011-000
纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭抗体）	BD Biosciences	553141
大鼠抗小鼠 IgG3	BD Biosciences	553401