在本实验方案中，我们展示了重组表达的膜蛋白 MexB 作为可溶性蛋白-去垢剂复合物的表达、增溶及纯化过程。MexB 是来自机会性细菌病原体铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的一种多重耐药膜转运蛋白。
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摘要
摘要
多药耐药性（MDR）是指癌细胞或病原体对结构和功能上互不相关的多种抗癌药物或抗生素产生耐药性的能力，是当前公共卫生领域的一个严重问题。这种多药耐药性在很大程度上归因于依赖能量的药物外排泵。这些外排泵将抗癌药物或抗生素排出细胞外，使其胞内浓度降至毒性阈值以下。我们正在研究多药耐药性在 铜绿假单胞菌一种机会性细菌病原体，可导致多种创伤或疾病患者发生感染，例如烧伤或囊性纤维化患者，以及免疫功能受损的癌症、透析和移植患者。主要的多重耐药外排泵在 P. aeruginosa 由内膜质子-药物反向转运蛋白（RND）、外膜通道（OMF）和周质连接蛋白（MFP）组成的三联复合物 1-8RND 和 OMF 蛋白均为跨膜蛋白。跨膜蛋白占所有蛋白质的 30% 以上，并且是目前 65% 药物靶点的来源。由于其疏水性跨膜结构域的存在，这类蛋白在水相缓冲液中不溶。在纯化跨膜蛋白之前，必须筛选出含有温和去垢剂的缓冲条件，以使蛋白能够形成蛋白-去垢剂复合物（PDC）并实现增溶。 9-11在本示例中，我们使用一种RND蛋白，即 P. aeruginosa MexB 跨膜转运蛋白，用于演示如何表达跨膜蛋白的重组形式，使用去垢剂对其进行增溶，并纯化蛋白-去垢剂复合物。该通用方法可适用于多种其他重组表达膜蛋白的表达、纯化和增溶。所得蛋白-去垢剂复合物可用于后续生化或生物物理表征，包括X射线晶体结构测定或交联研究。
方案
1. 第1天：
MexB 来自 铜绿假单胞菌 由 pFB101 编码。MexB 基因从 P. aeruginosa 基因组DNA并插入pET30b+载体的NdeI和XhoI限制性酶切位点中。该构建体包含一个C末端六组氨酸标签。
- 质粒用于转化 E. coli 菌株 C43(DE3) 12，将转化子接种于含 30 ug/mL 卡那霉素的 LB 琼脂平板上。
2. 第2天：过夜培养
- 傍晚时，从新鲜的转化子菌落接种4份各3 mL、含30 μg/mL卡那霉素的LB培养物。或者，也可从冻存的甘油菌中接种培养物。
这些小型培养物在滚瓶机上培养 37°C 过夜。
3. 第3天：培养6升培养物：
- 次日早晨，用过夜培养物接种含有 30 µg/mL 卡那霉素的 150 mL LB 培养基。在 37°C 摇床中培养菌液。
- 下午，用小量培养物接种 6 个含有 30 µg/mL 卡那霉素的 1 L 2XYT 培养基，置于三角烧瓶（Fernbach flask）中（每瓶接种 25 mL，稀释倍数为 1:40）。在 37°C 培养至菌液 OD600 达到 0.4–0.6，约需 1.5 小时。
- 当菌液达到适当密度时，加入 0.5 mL 1 M IPTG 以诱导蛋白表达。将所有烧瓶重新放入摇床，在 30°C 继续培养过夜。
4. 第4天：收集细胞并纯化蛋白：
- 按如下方法向缓冲液中添加蛋白酶抑制剂、DNA酶和溶菌酶：向50 mL细胞重悬缓冲液中加入10 mg DNase I（终浓度0.1 mg/mL）、1片Complete无EDTA蛋白酶抑制剂片剂以及少量溶菌酶；向60 mL膜重悬缓冲液中加入1片蛋白酶抑制剂片剂；向另外50 mL膜重悬缓冲液中加入1片蛋白酶抑制剂片剂。将上述三种溶液均置于冰上保存。
- 将培养物在大容量离心机中以5,000 rpm离心30分钟，以收集细胞。
- 用100 mL细胞重悬缓冲液（50 mM NaP，pH 7.0，300 mM NaCl，2 mM MgCl2，1片Complete无EDTA蛋白酶抑制剂片剂，0.1 mg/mL DNAse I，少量溶菌酶）重悬细胞。
- 将细胞悬液在12,000 psi（762 gauge pressure）压力下通过French高压破碎仪两次。将细胞裂解物收集于预先冰浴冷却的瓶子中。
- 将细胞裂解物转移至SS34离心管中，在SS-34转子中以10,000 rpm、4°C离心30分钟，以去除细胞碎片。
- 小心将上清液转移至Ti647.5超速离心管中，在4°C下以40,000 rpm离心50分钟。弃去上清液。
- 用约25 mL膜重悬缓冲液（50 mM NaP，pH 7.0，300 mM NaCl，5%甘油，1片Complete无EDTA蛋白酶抑制剂片剂）重悬含有细胞膜的沉淀。
- 将膜悬液转移至洁净的离心管中，在Ti647.5转子中以40,000 rpm、4°C离心50分钟。
- 弃去上清液，并将洗涤后的膜沉淀用25 mL膜重悬缓冲液（50 mM NaP，pH 7.0，300 mM NaCl，5%甘油，1片Complete无EDTA蛋白酶抑制剂片剂）重悬。
5. 跨膜蛋白溶解：
- 向重悬的膜组分（约 25 mL）中加入 6 mL 10% DDM（最终去垢剂浓度 = 2% DDM），在 4 °C 下轻轻摇动混合物 2 小时。
- 将混合物在 Ti647.5 转子中于 4°C 以 40,000 rpm 离心 40 分钟，以分离可溶性蛋白-去垢剂复合物与不溶性蛋白。保留上清液，其中含有 MexB 蛋白-去垢剂复合物。
6. IMAC：
- 将高速离心后获得的上清液与在重悬缓冲液中平衡过的Talon金属亲和层析珠混合，在4°C下于旋转仪中孵育1小时。
- 将混合液倒入重力流层析柱中，弃去穿流液。
- 用20 mL（10个柱体积）IMAC结合与洗涤缓冲液（50 mM NaP，pH 7，300 mM NaCl，5%甘油，0.2% DDM）洗涤层析柱。
- 使用IMAC洗脱缓冲液（50 mM NaP，pH 7.0，300 mM NaCl，5%甘油，250 mM 咪唑，0.2% DDM）洗脱蛋白。
- 取15 μL洗脱组分样品，分别与15 μL 2X SDS上样缓冲液混合，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。在微量离心机中离心30秒。在10%聚丙烯酰胺SDS凝胶上分析样品，以评估各组分中MexB蛋白的含量和纯度。
- 合并含有MexB蛋白-去垢剂复合物的组分，并在4°C下使用离心浓缩装置进行浓缩。注意避免在此步骤中蛋白发生沉淀。
7. 凝胶过滤柱：
- 用洗脱缓冲液（50 mM NaP，pH 7.0，300 mM NaCl，5% 甘油，0.2% beta-辛基葡萄糖苷）预平衡 Superose 12 HL 30/10 柱，体积为 24 mL，并等待基线平稳。
- 用运行缓冲液冲洗 Akta 系统的上样环。
- 在将蛋白溶液上柱前，使用注射器滤膜过滤。
- 最多上样 240 μL 蛋白溶液，蛋白浓度最高可达 5 mg/mL。
- 运行 1.5 柱体积（36 mL）缓冲液，收集 0.25 mL 的组分。MexB 蛋白-去垢剂复合物应在洗脱体积约为 10–15 mL 处以峰形洗脱。
- 取峰组分的 5 μL 样品，按 1:1 体积比与 2× SDS 上样缓冲液混合。使用 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析各样品，以评估每管组分中 MexB 的含量和纯度。
- 合并含有纯 MexB 的组分。
8. 代表性结果：
图1包含来自IMAC柱的合并组分以及来自凝胶过滤柱的单个组分的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。经过凝胶过滤柱纯化后，考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶显示蛋白质已达到纯度。图2为凝胶过滤柱的洗脱曲线，显示了蛋白质-去垢剂复合物从柱中洗脱的主要峰。MexB蛋白的平均产量约为每6升2XYT培养液获得2 mg。
图1. MexB PDCs纯化的SDS-PAGE凝胶电泳图。 第1道：分子量标记物；第2道：合并的IMAC组分；第3–7道：凝胶过滤柱组分。
图 2. MexB 蛋白去污剂复合物（PDC）凝胶过滤结果示例。
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讨论
除了多药耐药性外，许多重要的细胞活动，包括离子转运、细胞间通讯、囊泡运输、细胞结构的维持以及宿主与病原体之间的相互作用，都涉及嵌入细胞膜中的蛋白质。跨膜蛋白占已知蛋白质总数的30%以上，也是目前大多数药物的作用靶点。跨膜蛋白的错误折叠或功能异常会导致重要的遗传性疾病，包括囊性纤维化和糖尿病。尽管跨膜蛋白具有极其重要的生物学意义，但相较于可溶性蛋白，人们对它们的结构和分子机制了解甚少。由于含有疏水序列，这类蛋白在表达和大量分离方面存在困难，也难以适用于许多生物化学和结构研究方法。
本方案展示了多药耐药（MDR）膜蛋白的表达、去垢剂增溶及纯化，以获得可溶性的蛋白-去垢剂复合物。这些方法经适当修改后，也可用于多种重组表达的跨膜蛋白。所获得的纯化蛋白-去垢剂复合物具有可溶性，可用于X射线晶体学结构解析的结晶试验，以及其他生物物理或生物化学表征，包括重建入脂质体或交联研究。
在纯化过程中，需特别注意避免蛋白质-去垢剂复合物在离心浓缩步骤中发生沉淀。在凝胶过滤步骤之前或之后，也可采用其他方法来浓缩PDC，例如使用极小的柱子和少量洗脱体...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本项目得到了美国国家科学基金会和生物分子科学学会向CJJ提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SDS 样品缓冲液 | Bio-Rad | 161-0737 | |
| C43(DE3) 大肠杆菌菌株 | Lucigen | 60345-1 | |
| 硫酸卡那霉素 | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| 2XYT 培养基 | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| LB 培养基 | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| 溶菌酶 | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| 完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂片剂 | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP 单碱性 | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP 双碱性 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| 甘油 | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-十二烷基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷 | Anatrace | D310 | |
| 15 ml 离心管 | Corning | 430052 | |
| 往复式摇床 | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Talon 金属亲和树脂 | Clontech Laboratories | 635503 | |
| 咪唑 | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% 聚丙烯酰胺 SDS-PAGE 凝胶 | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Tris/甘氨酸/SDS-PAGE 电泳缓冲液 | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Kaleidascope 预染蛋白质分子量标准品 | Bio-Rad | 161-0324 | |
| Superose 12 30/10 层析柱 | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Amicon 离心浓缩器 | EMD Millipore | UFC801024 | |
| 注射器滤器 | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Fernbach 三角烧瓶 | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| 用于放置 Fernbach 三角烧瓶的摇床 | Fisher Scientific | ||
| Akta 系统 | GE Healthcare | ||
| J6 大容量离心机，配备 JLA-8.1000 转子 | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1 L 离心瓶 | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| RC-5 离心机 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SS34 固定角转子及配套离心管 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sorvall 地面型超速离心机 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| T647.5 转子及带盖离心管 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French 压力裂解细胞仪 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
参考文献
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- Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).
- Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).
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- Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).
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