膜转运蛋白MexB多药耐药蛋白的表达、去垢剂增溶及纯化

摘要

在本实验方案中，我们展示了重组表达的膜蛋白 MexB 作为可溶性蛋白-去垢剂复合物的表达、增溶及纯化过程。MexB 是来自机会性细菌病原体铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的一种多重耐药膜转运蛋白。

摘要

多药耐药性（MDR）是指癌细胞或病原体对结构和功能上互不相关的多种抗癌药物或抗生素产生耐药性的能力，是当前公共卫生领域的一个严重问题。这种多药耐药性在很大程度上归因于依赖能量的药物外排泵。这些外排泵将抗癌药物或抗生素排出细胞外，使其胞内浓度降至毒性阈值以下。我们正在研究多药耐药性在 铜绿假单胞菌一种机会性细菌病原体，可导致多种创伤或疾病患者发生感染，例如烧伤或囊性纤维化患者，以及免疫功能受损的癌症、透析和移植患者。主要的多重耐药外排泵在 P. aeruginosa 由内膜质子-药物反向转运蛋白（RND）、外膜通道（OMF）和周质连接蛋白（MFP）组成的三联复合物 ^1-8RND 和 OMF 蛋白均为跨膜蛋白。跨膜蛋白占所有蛋白质的 30% 以上，并且是目前 65% 药物靶点的来源。由于其疏水性跨膜结构域的存在，这类蛋白在水相缓冲液中不溶。在纯化跨膜蛋白之前，必须筛选出含有温和去垢剂的缓冲条件，以使蛋白能够形成蛋白-去垢剂复合物（PDC）并实现增溶。 ^9-11在本示例中，我们使用一种RND蛋白，即 P. aeruginosa MexB 跨膜转运蛋白，用于演示如何表达跨膜蛋白的重组形式，使用去垢剂对其进行增溶，并纯化蛋白-去垢剂复合物。该通用方法可适用于多种其他重组表达膜蛋白的表达、纯化和增溶。所得蛋白-去垢剂复合物可用于后续生化或生物物理表征，包括X射线晶体结构测定或交联研究。

方案

1. 第1天：

MexB 来自 铜绿假单胞菌 由 pFB101 编码。MexB 基因从 P. aeruginosa 基因组DNA并插入pET30b+载体的NdeI和XhoI限制性酶切位点中。该构建体包含一个C末端六组氨酸标签。

1. 质粒用于转化 E. coli 菌株 C43(DE3) ¹²，将转化子接种于含 30 ug/mL 卡那霉素的 LB 琼脂平板上。

2. 第2天：过夜培养

2. 傍晚时，从新鲜的转化子菌落接种4份各3 mL、含30 μg/mL卡那霉素的LB培养物。或者，也可从冻存的甘油菌中接种培养物。
   这些小型培养物在滚瓶机上培养 37°C 过夜。

3. 第3天：培养6升培养物：

3. 次日早晨，用过夜培养物接种含有 30 µg/mL 卡那霉素的 150 mL LB 培养基。在 37°C 摇床中培养菌液。
4. 下午，用小量培养物接种 6 个含有 30 µg/mL 卡那霉素的 1 L 2XYT 培养基，置于三角烧瓶（Fernbach flask）中（每瓶接种 25 mL，稀释倍数为 1:40）。在 37°C 培养至菌液 OD<....

讨论

除了多药耐药性外，许多重要的细胞活动，包括离子转运、细胞间通讯、囊泡运输、细胞结构的维持以及宿主与病原体之间的相互作用，都涉及嵌入细胞膜中的蛋白质。跨膜蛋白占已知蛋白质总数的30%以上，也是目前大多数药物的作用靶点。跨膜蛋白的错误折叠或功能异常会导致重要的遗传性疾病，包括囊性纤维化和糖尿病。尽管跨膜蛋白具有极其重要的生物学意义，但相较于可溶性蛋白，人们对它们的结构和分子机制了解甚少。由于含有疏水序列，这类蛋白在表达和大量分离方面存在困难，也难以适用于许多生物化学和结构研究方法。

本方案展示了多药耐药（MDR）膜蛋白的表达、去垢剂增溶及纯化，以获得可溶性的蛋白-去垢剂复合物。这些方法经适当修改后，也可用于多种重组表达的跨膜蛋白。所获得的纯化蛋白-去垢剂复合物具有可溶性，可用于X射线晶体学结构解析的结晶试验，以及其他生物物理或生物化学表征，包括重建入脂质体或交联研究。

在纯化过程中，需特别注意避免蛋白质-去垢剂复合物在离心浓缩步骤中发生沉淀。在凝胶过滤步骤之前或之后，也可采用其他方法来浓缩PDC，例如使用极小的柱子和少量洗脱体.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SDS 样品缓冲液	Bio-Rad	161-0737
C43(DE3) 大肠杆菌菌株	Lucigen	60345-1
硫酸卡那霉素	Sigma-Aldrich	K4378
2XYT 培养基	Fisher Scientific	BP2466-2
LB 培养基	Fisher Scientific	AC61189-5000
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
DNaseI	Fisher Scientific	BP3226-1
溶菌酶	Sigma-Aldrich	L7651
完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂片剂	Roche Group	11 873 580 001
NaP 单碱性	Sigma-Aldrich	S6566
NaP 双碱性	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
MgCl2	Sigma-Aldrich	M1028
甘油	Fisher Scientific	BP229-1
n-十二烷基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷	Anatrace	D310
15 ml 离心管	Corning	430052
往复式摇床	Fisher Scientific	SSL 4
Talon 金属亲和树脂	Clontech Laboratories	635503
咪唑	Sigma-Aldrich	I5513
10% 聚丙烯酰胺 SDS-PAGE 凝胶	Bio-Rad	161-1454
Tris/甘氨酸/SDS-PAGE 电泳缓冲液	Bio-Rad	161-0732
Kaleidascope 预染蛋白质分子量标准品	Bio-Rad	161-0324
Superose 12 30/10 层析柱	GE Healthcare	12 10/300 GL
Amicon 离心浓缩器	EMD Millipore	UFC801024
注射器滤器	Fisher Scientific	SLFG R04 NL
Fernbach 三角烧瓶	Fisher Scientific	09-552-39
用于放置 Fernbach 三角烧瓶的摇床	Fisher Scientific
Akta 系统	GE Healthcare
J6 大容量离心机，配备 JLA-8.1000 转子	Beckman Coulter Inc.
1 L 离心瓶	Beckman Coulter Inc.	969329
RC-5 离心机	Thermo Fisher Scientific, Inc.
SS34 固定角转子及配套离心管	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Sorvall 地面型超速离心机	Thermo Fisher Scientific, Inc.
T647.5 转子及带盖离心管	Thermo Fisher Scientific, Inc.	08322
French 压力裂解细胞仪	Thermo Fisher Scientific, Inc.	FA-032