本文介绍了在视觉皮层中通过颅内注射腺相关病毒（AAV）载体对神经元和胶质细胞进行荧光标记的方法。
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本文内容
摘要
摘要
将携带荧光蛋白表达元件的病毒载体进行颅内注射，是一种灵活的标记技术，可用于在活体（in vivo）以及脑切片中对不同脑区特定细胞亚群进行可视化观察。与荧光染料注射相比，病毒标记技术能够靶向特定细胞类型，且相较于建立转基因小鼠品系，成本更低、耗时更短。本技术通过立体定位坐标，使用微量移液器和自动泵将腺相关病毒（AAV）载体精确注射至颅内目标区域，在对周围组织造成最小损伤的同时实现精准递送。注射参数可根据具体实验需求进行优化，包括注射时动物的年龄、注射位点、注射体积、注射速率、AAV血清型以及驱动基因表达的启动子。根据所选条件的不同，病毒介导的外源基因表达可实现对细胞群体、单个细胞乃至精细的细胞结构（如树突棘水平）的可视化。本文所示实验为在小鼠初级视皮层注射双链AAV，以表达绿色荧光蛋白，用于标记该区域的神经元和胶质细胞。
方案
1. 病毒操作与保存
- 应根据所用病毒的生物安全等级选择适当的防护和操作技术。这些操作规范可在《微生物和生物医学实验室生物安全》第五版中找到。th 第几版，可在美国疾病控制与预防中心（CDC）网站获取
(http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm）。AAV 载体的使用属于生物安全等级 1（BSL-1）范畴。本实验中，操作病毒时需穿戴实验服和手套，遵循 BSL-1 试剂的操作规程。 - 为保持病毒的活性，最好将其分成小份，以避免反复冻融。
- 准备II级生物安全柜（BSC），用于病毒分装：清除BSC内所有不必要的物品，并用70%乙醇对表面进行消毒。在柜内放置一个盛有10%次氯酸钠溶液的烧杯，用于收集AAV污染性废弃物。同时将无菌0.5 mL离心管和一个干冰容器放入BSC中。
- 在生物安全柜外将病毒原液置于冰上解冻。
- 在生物安全柜内涡旋病毒并打开管盖。
- 将所需体积的分装液（例如 5 μL）移液至 0.5 mL 离心管中，盖紧管盖，并放入干冰中对病毒进行速冻。
- 当所有病毒分装完毕后，将病毒管和移液器吸头丢弃至含有10%次氯酸钠的废液容器中。
- 从通风橱中取出废液容器，....
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讨论
病毒介导的基因递送在神经系统过程研究及脑部疾病治疗中具有广阔的应用前景1,2,3该技术的高度多功能性还可用于荧光标记细胞，以实现成像 体外 和 体内4本文展示了利用表达增强型绿色荧光蛋白的双链腺相关病毒对小鼠视觉皮层神经元和胶质细胞进行转导的详细实验步骤。
尽管该技术相对简单直接，但仍有一些技术细节需要考虑。一个重要的因素是注射引起的组织损伤——因此在手术过程中以及微移液管的插入和取出时必须格外小心。手术失败可能导致需要成像的结构发生改变。此外，在将病毒装入微移液管后，必须仔细清除移液管尖端的任何气泡，并确保注入正确的体积。将微移液管略微下降至目标Z坐标以下，然后回撤至正确位置，可防止病毒从注射部位溢出。在选择孵育时间时，应考虑为病毒基因表达留出足够的时间，具体时间取决于所使用的病毒类型。注射可能会引发轻微的免疫反应。根据我们的经验，这种炎症通常仅局限于针道，可通过远离注射部位（约50 μm或更远）进行成像来避免。最后，如果脑切片需要封片，建议使用抗荧光淬灭封片剂以保持荧光信号。
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披露
动物实验方案已获得罗切斯特大学动物资源委员会（UCAR）批准，符合《公共卫生服务实验室动物人道护理与使用政策》的规定。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH，项目号 EY012977）、Burroughs Wellcome 基金会生物医学科学职业奖、Whitehall 基金会以及 Sloan 基金会（A.K.M.）的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| St–lting 小鼠和新生大鼠适配器 | Stoelting 公司 | 51625 | 可使用常规立体定位仪固定动物以进行手术 |
| 超细型 Bonn 剪刀，8.5 cm，直头，刃长 13 mm | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| 眼科敷料镊，10 cm，尖端宽度 0.5 mm，弯曲 | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5/45 镊子 - Dumoxel 标准尖端，11 cm，倾斜 | Fine Science Tools | 11251-35 | 用于开颅手术的超细尖镊子 |
| 标准型镊子，直头，尖端尺寸 2.5 mm × 1.35 mm，12 cm | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Microtorque 控制箱及 Tech2000 手持装置 | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | 牙科钻 |
| 微型钻不锈钢钻头，尖端直径 1.4 mm | Fine Science Tools | 19008-14 | |
| Wiretrol 微量移液器，用于输送 1–5 µL | VWR 国际公司 | 5-000-1001 或 53480-287 | |
| 矿物油 | VWR 国际公司 | 29447-338 | |
| 手动显微操作器及倾斜底座（右手型） | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3-R | 用于确定立体定位坐标 |
| 超微量泵 (UMP3)（一台）配 SYS-Micro4 控制器 | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | |
| 缝合线 | VWR 国际公司 | 95056-952 | |
| P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Tobradex | 可从您所在机构’s 兽医服务部门获取 |
参考文献
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
- Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U.
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