我们描述了制备不同发育阶段的 黑腹果蝇 用于在胚胎发育过程中可视化胚胎神经系统的胚胎样本。
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本文内容
摘要
摘要
Drosophila 胚胎是研究神经元发育细胞与分子基础的优良模型系统。本文描述了利用神经元蛋白抗体对 Drosophila 胚胎神经系统进行可视化观察的实验流程。由于胚胎期的外周神经系统和中枢神经系统在单个细胞水平上已有明确的特征描述（Dambly-Chaudière et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989），因此使用针对不同神经元蛋白的抗体可轻松识别这些系统中的任何异常。为确保胚胎处于适合观察的正确发育阶段，需在特定时间点收集正在发育的胚胎。收集后，在固定前需去除胚胎外部的两层结构，即卵壳膜和包裹胚胎的卵黄膜。随后将胚胎与神经元抗体孵育，并使用荧光标记的二抗进行可视化检测。在发育阶段12至17期间对胚胎进行观察，以评估其神经系统发育情况。在第12阶段，中枢神经系统（CNS）的成虫带开始缩短；到第15阶段，联合神经纤维的最终模式已形成；至第17阶段，中枢神经系统收缩完成，外周神经系统（PNS）亦完全发育（Campos-Ortega et al., 1985）。因此，在这些发育阶段中，PNS和CNS的形态变化可被清晰地观察到。
方案
1. 试剂的准备
- 使用 100 mM Pipes、2 mM EGTA 和 1 mM MgSO4 配制 PEMFA 缓冲液。将缓冲液 pH 调至 7.0。PEMFA 缓冲液经滤膜除菌后，于 4°C 保存。
- 在 100 ml 1× PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH 7.0）中加入 1 ml Triton X-100 配制 PBT。4°C 保存。
- 在 1× PBS（pH 7.0）中配制含 0.01% NaAcide 的 5% BSA（牛血清白蛋白）溶液。
- 在去离子水中加入 0.7% NaCl 和 0.03% Triton X-100 配制盐溶液。
- 将 4 份 PEMFA 缓冲液与 1 份 37% 甲醛混合，配制固定液。
2. 胚胎的收集
- 准备一个笼子用于 果蝇 通过放置目标菌株 >一个含有琼脂喂养板和适配器的塑料瓶中放置100只果蝇。
- 将果蝇笼子置于室温避光环境中72小时，每8–12小时更换一次培养板，使果蝇适应笼内环境并避免滞卵。
- 实验过程中收集胚胎12小时。将培养皿从容器中取出并更换新的培养皿。取下已移除的培养皿，用生理盐水和干净的画笔将胚胎从培养皿上冲洗下来。
- 用细筛收集胚胎，用生理盐水冲洗以去除多余的酵母。
- 用刮勺轻轻挑起胚胎，放入带盖的小玻璃瓶中，加入约1 ml生理盐水。
3. 脱除卵膜和卵黄膜并固定
- 收集胚胎后，通过将50%正庚烷与50%固定液混合配制Heptane-Fix溶液。该溶液将分层，上层为正庚烷，下层为固定液。
- 在玻璃小瓶中，将胚胎置于盐溶液中孵育5分钟以进行清洗。使用巴斯德吸管去除多余的盐溶液。
- 用去离子水冲洗胚胎。
- 将胚胎在50%次氯酸钠溶液中孵育3分钟以去除卵壳。
- 用去离子水彻底冲洗胚胎。
- 将胚胎置于Heptane-Fix溶液中，在温和振荡条件下孵育30分钟以进行固定。
- 使用巴斯德吸管将固定液（下层）替换为甲醇，保留管中的正庚烷。剧烈振荡以去除卵黄膜。去卵黄膜后的胚胎将沉至管底。
- 用巴斯德吸管将胚胎转移至新的玻璃小瓶中。用甲醇冲洗胚胎五次，每次孵育5分钟。
4. 抗体染色、封片与可视化
- 将胚胎在50% PBT溶液与50%甲醇的混合液中复水5分钟，随后在100% PBT溶液中复水5分钟。
- 在4°C下，用含5% BSA和0.01% NaAcide溶液的封闭液孵育胚胎1小时，以进行封闭。
- 胚胎现已准备好进行抗体染色。使用含5% BSA和0.01% NaAcide的溶液将一抗稀释至适当浓度。我们使用针对囊泡突触蛋白——半胱氨酸串蛋白（CSP）的抗体，以及抗-HRP（辣根过氧化物酶）抗体，后者可识别存在于细胞表面糖蛋白中的神经元特异性碳水化合物基团，从而标记所有神经元。
- 在4°C下，将胚胎于一抗溶液中孵育过夜。
- 次日，在1小时内用PBT溶液洗涤胚胎10次。
- 将二抗稀释至适当浓度，制备二抗溶液。我们使用的Alexa荧光标记二抗稀释比例为1:200。
- 在4°C下，将胚胎于二抗溶液中孵育2小时。
- 在1小时内用PBT溶液洗涤胚胎10次。
- 将胚胎在Vectashield封片介质中孵育过夜。
- 将胚胎封片于载玻片上，并用指甲油封固盖玻片。使用荧光显微镜观察胚胎。
5. 代表性结果
CSP
HRP-FITC
合并
图 1： 使用抗 CSP（红色）和 HRP（绿色）抗体显示 16–17 发育阶段胚胎中枢神经系统的代表性图像。注意联合部位的明显染色。
CSP
HRP-FITC
合并图像
图 2： 使用抗 CSP（红色）和 HRP（绿色）抗体标记的第 16–17 发育阶段胚胎周围神经系统（PNS）的代表性图像。注意周围神经元呈现的重复性分布模式。
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讨论
这 果蝇 胚胎是研究神经发育过程中细胞和分子变化的有力系统。本方案中，我们展示了如何制备用于免疫组织化学的整装胚胎样本。本方案改编自Carroll和Scott（1985）所述方法。该方案也可适用于检测其他神经元抗体，但需对抗体条件进行优化。此外，通过比较不同突变品系的胚胎，可直观地观察胚胎外周神经系统（PNS）和中枢神经系统（CNS）的发育缺陷。我们已成功应用此方案对携带运动蛋白突变的胚胎中的PNS和CNS进行可视化观察。在高倍镜下，我们还评估了胚胎PNS和CNS内的轴突走行路径。
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致谢
SG 获得纽约州立大学布法罗分校和约翰·R·奥伊谢基金会的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 37% 甲醛 | Fisher Scientific | BP531-25 | |
| CSP | 发育研究杂交瘤库 | ||
| HRP-FITC | Jackson ImmunoResearch | 323-095-021 | |
| Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Vectashield 封片介质 | Vector Laboratories | H-1000 |
参考文献
- Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
- Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages. Neuron. 3, 21-32 (1989).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Carroll, S. B., Scott, M. P. Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis. Cell. 43, 47-57 (1985).
- Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Muscle connections between imaginal discs in Drosophila. Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).
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