我们描述了制备不同发育阶段的 黑腹果蝇 用于在胚胎发育过程中可视化胚胎神经系统的胚胎样本。
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本文内容
摘要
摘要
Drosophila 胚胎是研究神经元发育细胞与分子基础的优良模型系统。本文描述了利用神经元蛋白抗体对 Drosophila 胚胎神经系统进行可视化观察的实验流程。由于胚胎期的外周神经系统和中枢神经系统在单个细胞水平上已有明确的特征描述（Dambly-Chaudière et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989），因此使用针对不同神经元蛋白的抗体可轻松识别这些系统中的任何异常。为确保胚胎处于适合观察的正确发育阶段，需在特定时间点收集正在发育的胚胎。收集后，在固定前需去除胚胎外部的两层结构，即卵壳膜和包裹胚胎的卵黄膜。随后将胚胎与神经元抗体孵育，并使用荧光标记的二抗进行可视化检测。在发育阶段12至17期间对胚胎进行观察，以评估其神经系统发育情况。在第12阶段，中枢神经系统（CNS）的成虫带开始缩短；到第15阶段，联合神经纤维的最终模式已形成；至第17阶段，中枢神经系统收缩完成，外周神经系统（PNS）亦完全发育（Campos-Ortega et al., 1985）。因此，在这些发育阶段中，PNS和CNS的形态变化可被清晰地观察到。
方案
1. 试剂的准备
- 使用 100 mM Pipes、2 mM EGTA 和 1 mM MgSO4 配制 PEMFA 缓冲液。将缓冲液 pH 调至 7.0。PEMFA 缓冲液经滤膜除菌后，于 4°C 保存。
- 在 100 ml 1× PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH 7.0）中加入 1 ml Triton X-100 配制 PBT。4°C 保存。
- 在 1× PBS（pH 7.0）中配制含 0.01% NaAcide 的 5% BSA（牛血清白蛋白）溶液。
- 在去离子水中加入 0.7% NaCl 和 0.03% Triton X-100 配制盐溶液。
- 将 4 份 PEMFA 缓冲液与 1 份 37% 甲醛混合，配制固定液。
2. 胚胎的收集
- 准备一个笼子用于 果蝇 通过放置目标菌株 >一个含有琼脂喂养板和适配器的塑料瓶中放置100只果蝇。
- 将果蝇笼子置于室温避光环境中72小时，每8–12小时更换一次培养板，使果蝇适应笼内环境并避免滞卵。
- 实验过程中收集胚胎12小时。将培养皿从容器中取出并更换新的培养皿。取下已移除的培养皿，用生理盐水和干净的画笔将胚胎从培养皿上冲洗下来。
- 用细筛收集胚胎，用生理盐水冲洗以去除多余的酵母。 <....
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讨论
这 果蝇 胚胎是研究神经发育过程中细胞和分子变化的有力系统。本方案中，我们展示了如何制备用于免疫组织化学的整装胚胎样本。本方案改编自Carroll和Scott（1985）所述方法。该方案也可适用于检测其他神经元抗体，但需对抗体条件进行优化。此外，通过比较不同突变品系的胚胎，可直观地观察胚胎外周神经系统（PNS）和中枢神经系统（CNS）的发育缺陷。我们已成功应用此方案对携带运动蛋白突变的胚胎中的PNS和CNS进行可视化观察。在高倍镜下，我们还评估了胚胎PNS和CNS内的轴突走行路径。
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致谢
SG 获得纽约州立大学布法罗分校和约翰·R·奥伊谢基金会的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 37% 甲醛 | Fisher Scientific | BP531-25 | |
| CSP | 发育研究杂交瘤库 | ||
| HRP-FITC | Jackson ImmunoResearch | 323-095-021 | |
| Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Vectashield 封片介质 | Vector Laboratories | H-1000 |
参考文献
- Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
- Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of th....
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