在体 突触小泡的可视化 果蝇 幼虫节段性轴突

摘要

本实验方案介绍了对黑腹果蝇（Drosophila）幼虫进行活体解剖的操作，旨在对沿微管轨道运动的GFP标记轴突囊泡进行成像观察。

摘要

阐明轴突运输机制对于确定长距离运输缺陷如何影响不同神经系统疾病具有重要意义。这一基本过程中的缺陷可能对神经元功能和发育产生有害影响。我们开发了一种解剖方案，旨在暴露Drosophila幼虫体节神经以实时观察轴突运输。我们对该活体成像方案进行了改进，原始方案由 Hurd 和 Saxton（1996）发表，用于幼虫体节神经的免疫定位。精细的解剖操作和合适的缓冲液条件对于最大限度延长离体幼虫的存活时间至关重要。若操作得当，在生理条件下，离体幼虫可维持强烈的小泡运输达 2–3 小时。我们采用 UAS-GAL4 方法¹使用不同的神经元GAL4驱动子，可在幼虫节段神经的单个或多个轴突中表达GFP标记的APP或突触结合蛋白囊泡。在观察前，也可将其他荧光标记物（例如线粒体染料MitoTracker或溶酶体染料LysoTracker）应用于幼虫。利用不同波长可同时观察GFP囊泡的运动和颗粒的运动。

方案

1. 试剂的准备

1. 通过加入以下成分配制解剖缓冲液：128 mM NaCl、1 mM EGTA、4 mM MgCl₂、2 mM KCl、5 mM HEPES 和 36 mM 蔗糖，定容至 1000 mL，用氢氧化钠调节 pH 至 7.2，并过滤除菌。

2. 解剖前的准备

1. 硅胶块：将凝胶切成约一英寸宽、一英寸长、约1厘米高的小块。解剖时将凝胶块置于载玻片上。同一凝胶块可多次使用。
2. 解剖针：用于解剖的针必须特别短。微型解剖针的尖锐底部在解剖操作中效果最佳。
3. 需要一把锋利的显微解剖弹簧剪。
4. 需要两把尖头镊子。

3. 幼虫采集

1. 收集表达GFP标记的囊泡蛋白的游走期3^rd 龄幼虫至培养皿中。
2. 用去离子水清洗幼虫，以去除所有食物残留。

4. 幼虫的活体解剖

1. 将幼虫转移至载玻片上的解剖凝胶块中，用解剖缓冲液浸没幼虫。
2. 幼虫用两根细针分别固定于前端和后端，背面向上。
3. 使用显微解剖剪在靠近后端的中线处做一个小切口。从该切口处向前端方向剪开。使用两枚针将切开的角质层固定在两侧边缘。
4. 加入一滴解剖缓冲液。用镊子小心移除肠道、肠管和脂肪体。大多数情况下，这些组织在背侧切开时会自然渗出。
5. 用新鲜的解剖缓冲液替换原有缓冲液。幼虫应始终保持浸没在解剖缓冲液中，切勿使其干燥。
6. 使用以下孵育步骤 体内 此时使用 MitoTracker 或 LysoTracker 荧光探针进行标记，通过稀释 体内 在解剖缓冲液中加入标记物。孵育结束后 体内 用新鲜的解剖缓冲液对解剖后的幼虫进行多次清洗（快速清洗5次）。
7. 更换最后一次洗涤液后，立即将针插入硅胶并加盖盖玻片。此时幼虫已准备好进行观察。

5. 解剖后幼虫的活体成像

1. 将盖玻片和凝胶置于倒置显微镜的载物台上，进行成像。
2. 我们使用100倍物镜对幼虫节段神经中标记的囊泡进行成像。首先评估腹神经节细胞体中的GFP表达，然后对节段神经进行成像。若在腹神经节细胞体中观察到强烈的GFP染色，则对该神经进行成像并用于后续分析。
3. 使用配备 CFP/YFP 或 RFP/YFP 滤光片的双视野系统及分光成像软件，可同时对两种标记蛋白进行成像 体内.

6. 代表性结果

图1：幼虫节段神经内多条轴突轨迹上存在大量轴突囊泡的代表性图像。 注意GFP的斑点状信号，代表轴突内的聚集物。

图2：代表性图像，显示幼虫节段神经中一条含有多个轴突囊泡的单根轴突轨迹。

讨论

体内成像技术可用于观察果蝇幼虫体节神经中突触小泡的运输过程，是研究轴突运输机制的有力工具。我们此前已利用该方案评估表达扩展多聚谷氨酰胺（polyQ）重复序列的幼虫神经中的运输动力学，以阐明重复序列的扩增如何影响小泡运输的动力学特征³。通过本方案，可将视频流转换为线描图（kymograph），从而测定小泡运动的速度。利用遗传学手段，可通过特异性的GAL4驱动子驱动GFP表达，从而在单个或多个轴突中可视化GFP标记的小泡运输。此外，还可观察携带特定基因突变的幼虫中运输动力学的变化。进一步地，可同时可视化两种分别标记了不同GFP变体（CFP或RFP）的小泡。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 对显微解剖剪刀	Fine Science Tools		弹簧剪刀 – 6 mm 刀片，0.125 mm 尖端直径
2 对镊子	Fisher Scientific		Fisherbrand 显微解剖有齿尖镊
一盒解剖针	Fine Science Tools		Minutien 针，直径 0.1 mm