用于分析细胞裂解液中多蛋白复合物的蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）

摘要

在本视频中，我们介绍了通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）对多蛋白复合物（MPCs）进行表征的方法。在第一维中，将透析后的细胞裂解液通过BN-PAGE分离，以鉴定各个MPCs。在第二维SDS-PAGE中，对感兴趣的MPCs进一步分离，以便通过免疫印迹分析其组成成分。

摘要

多蛋白复合物（MPCs）在细胞信号转导中发挥关键作用，因为大多数蛋白质都能与其他蛋白质形成具有功能或调控作用的复合物（Sali, Glaeser et al. 2003）。因此，要整合性地理解蛋白质的功能与调控机制，必须对MPCs进行详细表征，以研究蛋白质相互作用网络。为了实现MPCs的鉴定与分析，必须在天然条件下对其进行分离。在本视频中，我们介绍了利用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）对MPCs进行分析的方法。BN-PAGE技术能够在保持MPCs天然构象的前提下，提供比凝胶过滤或蔗糖密度超速离心更高的分辨率，因此适用于确定MPCs的大小、组成及相对丰度（Schägger 和 von Jagow 1991）；（Schägger, Cramer et al. 1994）。该方法依据蛋白质在聚丙烯酰胺基质中的流体动力学大小和形状进行分离。在此，我们以全细胞裂解液中的MPCs分析为例，强调裂解液的透析是使BN-PAGE适用于此类生物样本的关键步骤。通过第一维BN-PAGE与第二维SDS-PAGE相结合的方法，我们展示了经BN-PAGE分离的MPCs可进一步通过SDS-PAGE分解为其各个组分。凝胶分离后的MPC组分通过标准免疫印迹技术进行检测。作为BN-PAGE分析MPCs的示例，我们选用了已被充分表征的真核生物19S、20S和26S蛋白酶体。

方案

**本视频方案基于以下相关出版物 ¹：用于多蛋白复合物鉴定与分析的蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）。Mahima Swamy, Gabrielle M. Siegers, Susana Minguet, Bernd Wollscheid, 和 Wolfgang W. A. Schamel。Science's STKE 2006 (345): pl2，2006年7月25日，[DOI: 10.1126/stke.3892006pl4]。请点击此处查看该出版物。

1. 透析细胞裂解液的制备

1. 收集 10×10⁶ 个细胞，于 4°C 下以 350g 离心 5 分钟，形成沉淀。
2. 用 1 mL 冰冷的 PBS（配方 1）洗涤细胞沉淀三次，每次均按步骤 1.1 的条件进行离心。
3. 将沉淀重悬于 250 μL 冰冷的 BN-裂解缓冲液（配方 2）中，冰上孵育 15 分钟。
4. 于 4°C 下以 13,000g 离心 15 分钟，去除不溶性物质。
5. 使用加热的巴斯德吸管粗端在 1.5 mL 微量离心管盖上熔出一个小孔，然后将管子置于冰上冷却至 4°C。
6. 将步骤 1.4 中的上清液转移至管盖带孔的预冷管中。
7. 用镊子将透析膜（截留分子量为 10 kD）覆盖在打开的管口上，拧紧管盖，并剪去突出的多余透析膜。
8. 用封口膜小心地将管盖侧面密封。
9. 将管子倒置，放入 50 mL 圆锥形离心管中，在细胞培养离心机中以尽可能低的速度于 4°C 倒置离心 10 秒。使用镊子从离心机中取出倒置的管子，避免将其翻转回正立状态。
10. 准备一个 100 mL 烧杯，加入冰冷的 BN-透析缓冲液（配方 3）并放置于搅拌台上。每 100 μL 样品至少使用 10 mL BN-透析缓冲液。
11. 用胶带将管子倒置固定在烧杯内，并使用弯曲的巴斯德吸管去除管盖下方小孔处的气泡。
12. 将烧杯置于磁力搅拌器上，开启搅拌器，在冷藏室中搅拌 6 小时或过夜。定期检查，确保搅拌过程中未在透析膜处产生气泡。
13. 将透析后的细胞裂解液收集至新的预冷微量离心管中。

2. BN胶的制备

1. 使用梯度混合器在室温下进行梯度凝胶灌注。必须佩戴手套，因为丙烯酰胺具有高度神经毒性。避免与SDS发生任何接触。
2. 将梯度混合器放置在搅拌台上，并连接一段软管。使用阀门关闭通道，并用夹子夹紧软管。将磁力搅拌子放入与软管相连的“高”筒中，位置约为筒深的15%。
3. 将软管穿过蠕动泵，并在其末端连接一个注射器针头。然后将针头置于凝胶装置的两块玻璃板之间。
4. 配制4%（配方5）和15%（配方6）的分离胶溶液，在使用前立即加入APS和TEMED。总体积应等于分离胶所需体积。
5. 将上述凝胶溶液分别倒入梯度混合器对应的筒中（4%倒入“低”筒，15%倒入“高”筒）。
6. 打开阀门，用拇指按压左侧筒体，排出连接两个凝胶储液筒之间的通道内的气泡。
7. 启动磁力搅拌器，移除夹子，并将蠕动泵调至每分钟5 ml。使凝胶缓慢流入两块玻璃板之间。确保针头始终位于液面之上。
8. 待所有液体进入凝胶装置后，轻轻覆盖异丙醇。在室温下静置至少30分钟，使凝胶充分聚合。
9. 立即用dH₂O清洗灌胶装置（切勿使用洗涤剂）。
10. 去除异丙醇，用dH₂O冲洗，并用Whatman滤纸吸干dH₂O。
11. 配制3.2%的浓缩胶（配方7），在使用前立即加入APS和TEMED。
12. 将浓缩胶浇注在分离胶上方，并将梳子插入两块玻璃板之间，避免产生气泡。待浓缩胶聚合完成后，将凝胶冷却至4°C。
13. 在上样前立即缓慢拔出梳子，以一定角度从凝胶平面拉出。此操作可使空气迅速进入加样孔，从而提高加样孔的质量。

3. 通过 BN-PAGE 分离透析后的细胞裂解液

1. 在4°C条件下，向干燥的加样孔中加入1至40 μL透析后的裂解液和10至20 μL标记物混合液（配方10）。每个加样孔中的样品上方覆盖冷的阴极缓冲液（配方8）。
2. 用冷的阴极缓冲液填充内槽，用冷的阳极缓冲液（配方9）填充外槽（下槽）。
3. 对小型凝胶施加100 V电压，对大型凝胶施加150 V电压，直至样品进入分离胶。电泳过程在4°C下进行。
4. 将电压升高至180 V（小型凝胶）或400 V（大型凝胶），继续电泳直至染料前沿到达凝胶底部。小型凝胶电泳时间为3至4小时，大型凝胶为18至24小时。

4. 第二维 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

1. 制备标准的10% SDS-凝胶（配方12-15），设置一个用于第一维BN-PAGE条带的宽泳道，一个用于分子量标记物的常规泳道，以及一个用于已与SDS上样缓冲液（配方11）混合并在95°C下煮沸5分钟的透析后裂解液等分试样的常规泳道。使用厚度增加两层透明胶带的垫片，以简化将BN-PAGE凝胶条带加载到SDS-凝胶上的操作。
2. 从电泳装置中取出带有玻璃板的BN-PAGE凝胶，并轻轻撬起其中一块玻璃板。
3. 去除浓缩胶，并切下含有目标蛋白的BN-PAGE凝胶泳道。
4. 将BN-PAGE凝胶条带放入2× SDS上样缓冲液中，在室温下孵育10分钟。
5. 在微波炉中短暂煮沸BN-PAGE凝胶条带（不超过20秒）。
6. 将BN-PAGE凝胶条带在热的SDS上样缓冲液中于室温再孵育15分钟。
7. 将BN-PAGE凝胶条带加载至SDS-PAGE凝胶浓缩胶上的宽加样孔中，避免产生气泡，并用SDS上样缓冲液覆盖凝胶条带。同时上样分子量标记物和裂解液对照样品。
8. 按照标准实验方案进行电泳。

5. 通过免疫印迹检测MPC亚基

1. 转膜时，准备六张与 SDS-凝胶大小相匹配的 Whatman 滤纸和一张 PVDF 膜。
2. 将 PVDF 膜浸入 100% 甲醇中 30 秒，并将 Whatman 滤纸浸泡在转移缓冲液（配方 16）中。
3. 将三张 Whatman 滤纸、PVDF 膜、SDS-凝胶（去除浓缩胶）以及另外三张 Whatman 滤纸按三明治结构依次放入半干式转膜槽中。
4. 以 20 V 电压转移 25 分钟。
5. 根据标准免疫印迹实验流程检测蛋白质。

6. 代表性结果

我们以真核生物19S、20S和26S蛋白酶体的分析为例，介绍通过二维BN/SDS-PAGE对膜蛋白复合物（MPC）进行表征的方法（图1A）。使用含有0.1% Triton X-100的缓冲液裂解HEK293细胞，该去垢剂可破坏细胞膜并溶解膜蛋白复合物。将这些裂解物在BN透析缓冲液中透析，以去除盐分和小分子代谢物。随后，MPC通过4-15%梯度BN-PAGE进行第一维分离，再进行第二维SDS-PAGE分离。通过免疫印迹法使用针对20S蛋白酶体亚基β2和Mcp21的抗体对蛋白质进行检测。

图 1. 利用细胞裂解物进行二维 BN-PAGE/SDS-PAGE 分析的方法。 （A）从细胞裂解物出发进行二维 BN-PAGE/SDS-PAGE 分析的流程图。（B）二维 BN-PAGE/SDS-PAGE 方法的示意图。在第一维中，蛋白质和蛋白复合物（MPCs）在非变性条件下通过 BN-PAGE 实现分离。在第二维中，BN-PAGE 分离后的凝胶条带中的蛋白质和/或蛋白复合物经 SDS 变性，随后进行 SDS-PAGE 分离。由于第一维使用梯度凝胶而第二维使用线性凝胶，单体蛋白质将沿一条双曲线迁移。某一特定蛋白复合物的组分则位于该对角线下方，并排列在一条垂直线上。

研究表明，通过第一维BN-PAGE与第二维SDS-PAGE联用，由于第一维使用梯度胶而第二维使用线性胶，单体蛋白会沿一条双曲线对角线迁移（(Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004)；图1B）。MPC组分位于该对角线下方。同一MPC的不同亚基在第二维中表现为一条垂直线上的多个蛋白点，而同一蛋白在水平方向上出现多个点则表明该蛋白存在于多个不同的MPC中。图2显示，在本实验中，针对β2和Mcp21的免疫印迹检测到含有这些蛋白酶体亚基的特异性蛋白复合物。这两种蛋白均以水平排列的独立蛋白点形式被检测到，表明β2和Mcp21是多个不同MPC的组成成分。根据其大小和组成，这些MPC可明确鉴定为26S蛋白酶体（20S加19S帽结构）、20S蛋白酶体与调节亚基PA28的复合物，以及单独的20S蛋白酶体。综上所述，这些结果表明，利用细胞裂解液通过二维BN-PAGE/SDS-PAGE方法可以鉴定和表征内源性MPC。该方法适用于确定MPC的大小、组成及相对丰度。

图 2. 通过二维 BN-PAGE/SDS-PAGE 后的免疫印迹检测真核蛋白酶体的不同形式。 为鉴定和分析真核蛋白酶体，使用 0.1% Triton X-100 裂解 HEK293 细胞。细胞裂解液经透析后，进行 BN-PAGE（4–15%）以分离 MPCs。随后进行第二维 SDS-PAGE（10%），以按大小分离各个亚基组分。免疫印迹使用特异性抗体检测 20S 核心复合物的 Mcp21 和 β2 亚基，以及调节亚基 PA28。

I. 特异性试剂表（按字母顺序排列）：

试剂	公司	备注
6-氨基己酸 (ε-氨基己酸)	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	该化学品具有刺激性，操作时应佩戴手套。
丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液 (40%)，32:1 混合	Applichem, Darmstadt, Germany	该溶液具有神经毒性，操作时应佩戴手套。
Bis-tris	Roth, Karlsruhe, Germany
Brij 96	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany
考马斯亮蓝 G250	Serva, Heidelberg, Germany	不得用其他类型的考马斯亮蓝染料替代，例如考马斯亮蓝 R250 或胶体考马斯亮蓝。
皂苷	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	皂苷具有毒性，处理含有该去垢剂的缓冲液或样品时应佩戴手套。
十二烷基麦芽糖苷	Applichem, Darmstadt, Germany
Triton X-100	Roth, Karlsruhe, Germany	Triton X-100 具有毒性，处理含有该去垢剂的缓冲液或样品时应佩戴手套。

II. 特定材料与设备列表：

仪器	公司
透析膜（分子量截留范围 10 至 50 kD）	Roth, Karlsruhe, Germany
凝胶电泳系统	例如 Bio-Rad, Munich, Germany
梯度混合器	自制或商业产品，如 Bio-Rad, Munich, Germany
蠕动泵	Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜	Immobilon-P, Millipore, Eschborn, Germany
半干转印设备	例如 Bio-Rad, Munich, Germany
硅胶管（直径 3 至 5 mm，长度 1 m）	NeoLab, Heidelberg, Germany

III. 配方表：

编号	缓冲液与溶液	成分	备注
1	磷酸盐缓冲液（PBS）	Na2HPO4 8.1 mM KH2PO4 1.5 mM NaCl 138 mM KCl 2.7 mM	若配制正确，溶液pH应为7.4。
2	BN-裂解缓冲液	基础缓冲液 Bis-tris 20 mM ε-氨基己酸 500 mM NaCl 20 mM EDTA, pH 8.0 2 mM 甘油 10% 用HCl调节pH至7.0。4°C保存。 去垢剂 Digitonin 0.5 至 1.0% 或 Brij 96 0.1 至 0.5% 或 Triton X-100 0.1 至 0.5% 或 十二烷基麦芽糖苷 0.1 至 0.5% 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 抑肽酶 10 μg/mL 亮抑蛋白酶肽 10 μg/mL PMSF 1 mM 氟化钠 0.5 mM 正钒酸钠 0.5 mM	合适的去垢剂需通过实验确定，且应与其他裂解缓冲液配方中使用的去垢剂相同。 Digitonin必须在使用前立即加入，使用2%的dH2O储备液（分装为5 mL，-20°C保存）。 蛋白酶和磷酸酶抑制剂应在使用前立即加入。 加入正钒酸钠后，缓冲液会呈现淡黄色。
3	BN-透析缓冲液	基础缓冲液 Bis-tris 20 mM ε-氨基己酸 500 mM NaCl 20 mM EDTA, pH 8.0 2 mM 甘油 10% 用HCl调节pH至7.0。4°C保存。 去垢剂 Digitonin 0.3 至 0.5% 或 Triton X-100 0.1% 或 Brij 96 0.1% 或 十二烷基麦芽糖苷 0.1% 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 PMSF 1 mM 正钒酸钠 0.5 mM	合适的去垢剂需通过实验确定，且应与其他裂解缓冲液中使用的去垢剂相同，但浓度应为所示的较低水平。 必须加入去垢剂以防止在凝胶电泳的浓缩步骤中发生聚集。 蛋白酶和磷酸酶抑制剂应在使用前立即加入。
4	3x BN-凝胶缓冲液	Bis-tris 150 mM ε-氨基己酸 200 mM 用HCl调节pH至7.0。4°C保存。
5	4% 分离胶	3x BN-凝胶缓冲液（配方4）5.00 mL 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 1.50 mL dH2O 8.50 mL APS, 10% in dH2O 54 μL TEMED 5.4 μL	由于APS和TEMED可促进聚合反应，因此应在灌胶前立即加入。 此配方足够制备30 mL凝胶。根据所制凝胶的数量和大小调整体积。
6	15% 分离胶	3x BN-凝胶缓冲液（配方4）5.00 mL 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 5.63 mL 70%甘油 4.38 mL APS, 10% in dH2O 42 μL TEMED 4.2 μL	由于APS和TEMED可促进聚合反应，因此应在灌胶前立即加入。 此配方足够制备30 mL凝胶。根据所制凝胶的数量和大小调整体积。 丙烯酰胺-双丙烯酰胺浓度可根据需要在10%至18%之间调整。
7	3.2% 浓缩胶	3x BN-凝胶缓冲液（配方4）3.00 mL 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 0.72 mL dH2O 5.28 mL APS, 10% in dH2O 120 μL TEMED 12 μL	由于APS和TEMED可促进聚合反应，因此应在灌胶前立即加入。 此配方足够制备30 mL凝胶。根据所制凝胶的数量和大小调整体积。
8	阴极缓冲液	Bis-tris 15 mM 三羟甲基甘氨酸 50 mM 考马斯亮蓝G250 0.02% 配制1升10倍浓缩储备液，用HCl调节pH至7.0，4°C保存。 使用前用dH2O按1:10稀释。	不得使用其他类型的考马斯染料，如考马斯亮蓝R250或胶体考马斯亮蓝。
9	阳极缓冲液	Bis-tris 50 mM 配制1升10倍浓缩储备液，用HCl调节pH至7.0，4°C保存。 使用前用dH2O按1:10稀释。
10	标准蛋白混合物	醛缩酶（158 kD）10 mg/mL 过氧化氢酶（232 kD）10 mg/mL 铁蛋白（440 和 880 kD）10 mg/mL 甲状腺球蛋白（670 kD）10 mg/mL BSA（66 和 132 kD）10 mg/mL Bis-tris 20 mM NaCl 20 mM 甘油 10% 用HCl调节pH至7.0。4°C保存。	分子量标准蛋白也可从多个商业来源购买，包括Invitrogen或Pharmacia。
11	SDS上样缓冲液	Tris 12.5 mM SDS 4% 甘油 20% 溴酚蓝 0.02% 调节pH至6.8。为还原二硫键，加入9 mL β-巯基乙醇。	SDS粉末和β-巯基乙醇具有毒性，因此操作时应戴手套并在通风橱中进行。
12	4x下层缓冲液	Tris 1.5 M SDS 0.4% 调节pH至8.8。	SDS粉末具有毒性，因此操作时应戴手套并在通风橱中进行。
13	4x上层缓冲液	Tris 0.5 M SDS 0.4% 调节pH至6.8。	SDS粉末具有毒性，因此操作时应戴手套并在通风橱中进行。
14	10% 分离胶	丙烯酰胺（30%）2.0 mL 4x下层缓冲液 1.5 mL dH2O 2.454 mL APS, 10% in dH2O 40 μL TEMED 6 μL	由于APS和TEMED可促进聚合反应，因此应在灌胶前立即加入。 此配方足够制备30 mL凝胶。根据所制凝胶的数量和大小调整体积。
15	4.8% 浓缩胶	丙烯酰胺（30%）320 μL 4x上层缓冲液 500 μL dH2O 1.16 mL APS, 10% in dH2O 20 μL TEMED 2 μL	由于APS和TEMED可促进聚合反应，因此应在灌胶前立即加入。 此配方足够制备30 mL凝胶。根据所制凝胶的数量和大小调整体积。
16	半干转膜缓冲液	Tris 48 mM 甘氨酸 39 mM 甲醇 20% SDS 0.1% 用dH2O定容至1升。室温保存。	SDS粉末和甲醇具有毒性，因此操作时应戴手套并在通风橱中进行。

讨论

本研究中，我们介绍了通过非变性电泳（BN-PAGE）对线粒体蛋白复合物（MPCs）进行分析的方法。采用二维（2D）策略，首先在天然条件下分离MPCs，然后通过第二维SDS-PAGE将其进一步分解为各个独立组分。

样品由细胞裂解物制备。为了溶解许多膜蛋白复合物（MPC），需要使用适当的去垢剂，以保持蛋白复合物的结构。此处我们使用0.1%的Triton X-100。然而，每种MPC所需的最适去垢剂及其合适浓度需通过实验经验确定。例如，已有报道指出，低浓度的Triton X-100可保留F₁F₀-ATP酶复合物的二聚体形式（Arnold, Pfeiffer 等. 1998）。然而，较高浓度的Triton X-100则会导致二聚体解离，并相应增加单体形式的F₁F₀-ATP酶复合物。这与我们之前的一项研究结果一致：当使用低浓度Brij 96提取时，多价T细胞受体复合物（TCR）得以保留；而使用较高浓度或另一种称为皂苷（digitonin）的去垢剂则会导致单体TCR的提取（Schamel, Arechaga 等. 2005）。常用的可测试去垢剂包括皂苷（0.5%至1%）、Triton X-100（0.1%至0.5%）、Brij 96（0.1%至0.5%）或十二烷基麦芽糖苷（0.1%至0.5%）。这些试剂均为非离子型去垢剂，通常对维持MPC的稳定性最为有利。需注意应避免与SDS及其他强效去垢剂接触（Camacho-Carvajal, Wollscheid 等. 2004）。

为了在BN凝胶中实现MPC的分离，必须对裂解液进行透析（Camacho-Carvajal, Wollscheid 等. 2004）；（Heiss, Junkes 等. 2005）。似乎调节盐浓度或去除低分子量杂质对于获得高分辨率至关重要。值得注意的是，经过免疫纯化并随后从抗体上洗脱下来的膜组分和MPC也同样适用于BN-PAGE分析（Swamy, Siegers 等. 2006）。在这两种情况下，如果膜裂解或洗脱是在BN裂解缓冲液中进行的，则样品无需透析即可用于BN-PAGE分离。

进行BN-PAGE蛋白质分离时，需要使用考马斯亮蓝染料，该染料可非特异性地结合蛋白质并使其带上负电荷。因此，在中性pH条件下，考马斯亮蓝可使蛋白质在电泳中向阴极移动（Schägger 和 von Jagow 1991）；（Schägger, Cramer et al. 1994）。此外，考马斯亮蓝还能防止蛋白质在电泳过程中于浓缩胶中发生聚集。进行BN-PAGE时，必须使用考马斯亮蓝G250，而非考马斯亮蓝R250或胶体考马斯亮蓝染料。

在运行BN胶之前，必须确保胶的浓度百分比与目标MPC的预期大小相匹配。市面上可购买到不同梯度的预制BN胶及其配套缓冲液（Invitrogen，NativePAGE Novex Bis-Tris胶系统）。但也可以使用梯度混合器配合蠕动泵自行制备BN胶。为保证梯度完整，灌胶过程中液体应保持持续流动，并避免产生气泡。我们建议将样品的不同稀释度上样至胶中，因为过量上样可能导致电泳过程中蛋白质沉淀。此外，BN胶应在4°C下运行，以防止蛋白质降解并保持MPC的完整性。

BN-PAGE 之后，可通过考马斯亮蓝染色、银染或免疫印迹法对 MPC 进行可视化。通过考马斯亮蓝或银染显示的蛋白质条带适用于进一步的质谱分析（Camacho-Carvajal, Wollscheid 等. 2004）。若采用免疫印迹法，则需通过实验经验确定目标 MPC 的最佳转膜条件。需要注意的是，在 BN 胶转膜过程中，考马斯亮蓝也会被转移。因此，成功转膜后凝胶将变为无色，而膜上则呈现蓝色。此外，必须指出，并非所有在 SDS-PAGE 后检测中有效的初级抗体都适用于 BN-PAGE 后的免疫印迹。由于蛋白天然构象可能掩盖抗原表位，抗体可能无法识别目标 MPC。为解决此问题，可在转膜前通过将凝胶短暂置于 1× SDS 上样缓冲液中煮沸，使 BN 凝胶中的蛋白质变性。

在本示例中，我们并未直接对BN胶进行蛋白质条带的检测。相反，我们将经BN-PAGE分离的裂解液进一步通过第二维SDS-PAGE进行分离。在第二维SDS胶中，单体蛋白质由于第一维为梯度胶而第二维为线性胶，会沿一条双曲线对角线迁移（Camacho-Carvajal, Wollscheid 等. 2004）。这一特征有助于线粒体蛋白复合物（MPCs）的识别，因为它们的位置位于该双曲线对角线下方。同一特定MPC的亚基在第二维SDS-PAGE中表现为一条垂直线。而属于多个不同MPCs的组分则可根据MPC的大小在水平方向上被识别。然而需要注意的是，出现在同一条垂直线上的多个蛋白点也可能属于在BN-PAGE中迁移位置相同的独立复合物。要最终证实它们是否存在于同一MPC中，可通过基于抗体的胶迁移实验（gel shift assay）加以验证。在该实验中，细胞裂解液在进行BN-PAGE前先与针对某一已识别蛋白点所对应蛋白的抗体孵育。这将导致所有含有该蛋白的MPC在第一维中向更高分子质量方向发生迁移。其他同样属于这些MPC的蛋白质也会随之发生复合物特异性的迁移，因此可在第二维SDS胶中被明确识别。

不仅可以利用BN-PAGE分析MPCs的组成，还可确定其化学计量比（Schamel 和 Reth 2000）；（Schamel 2001），（Swamy, Minguet 等. 2007）。为此，可进行NAMOS检测（基于抗体的天然迁移率偏移检测）。与基于抗体的凝胶迁移偏移实验类似，将细胞裂解液与单克隆亚基特异性抗体孵育，从而在BN凝胶中诱导产生电泳免疫偏移，通过偏移程度可推断MPCs的化学计量关系。

总之，BN-PAGE 适用于 MPC 的鉴定及其大小、组成和相对丰度的确定。当作为 NAMOS 测定进行时，该方法还可用于确定特定 MPC 的化学计量比。由于其广泛的适用性，该技术是表征 MPC 的一种非常有用的工具（Dekker, Müller et al. 1996）；（Wittig 和 Schagger 2008）；（Wagner, Rehling et al. 2009）；（Wittig 和 Schägger 2009）。