通过体细胞核移植技术获得的针对Toxoplasma gondii具有预定义T细胞受体特异性的转基因核小鼠

摘要

本文展示了通过体细胞核移植（SCNT）进行表观遗传重编程可作为一种工具，用于构建具有预设T细胞受体（TCR）特异性的转基因小鼠模型。这些转基因小鼠在其内源性启动子的调控下，于内源性基因座表达相应的TCR。

摘要

淋巴细胞（如T细胞）通过基因V(D)J重排产生具有特定特异性的受体¹。携带重排抗原特异性T细胞受体（TCR）的转基因小鼠已成为研究T细胞发育与功能不可或缺的工具。然而，这类TCR通常是在长期培养后、往往经过多次抗原刺激后从相应T细胞中分离得到的，这一过程不可避免地会筛选出具有高亲和力的T细胞。TCR α链和β链的随机基因组整合以及在非内源性启动子驱动下的表达，可能导致表达水平和表达动力学的差异。

通过体细胞核移植实现的表观遗传重编程，为从任何感兴趣的细胞生成胚胎干细胞和小鼠提供了工具。因此，当体细胞核移植技术应用于已知特异性的T细胞时，这些遗传性的V(D)J重排会被转移至核移植胚胎干细胞（ESCs）以及由其衍生的小鼠中，同时表观遗传标记被重置。我们已证明，可利用对Toxoplasma gondii具有预定义特异性的T细胞，构建出能够在内源性基因座表达特异性TCR的小鼠模型，而无需通过实验手段引入遗传修饰。此类转基因核模型的构建相对简便且快速，为其他疾病模型的建立提供了广阔前景。

方案

本方法已用于所报告的研究中 基拉克 等，科学 328 (5975)，243-248 (2010).

1. 供体细胞的分离

在将特异性T细胞或B细胞用作供体细胞以构建转基因小鼠模型之前，需要先用感兴趣的病原体感染小鼠，或用感兴趣的抗原进行免疫。由于我们使用了针对Toxoplasma gondii的CD8+细胞，以下方案将描述这些细胞的制备与分离过程，实际操作中需根据研究需求进行相应调整。

1. 将来源于小鼠脑匀浆液的包囊（约40个）通过腹腔注射接种至BL/6 × Balb/c F1（B6CF1）小鼠体内，以分离出受H-2^b和H-2^d限制的CD8+ T细胞。
2. 在免疫反应高峰期，处死感染小鼠，取出脾脏并置于含有6 mL红细胞（RBC）裂解缓冲液的培养皿中。
3. 利用两张载玻片的磨砂面轻轻研磨脾脏，并在RBC裂解缓冲液中于室温孵育5分钟。
4. 加入14 mL PBS，将细胞悬液通过细胞筛（40或70 μm）过滤至50 mL离心管中，以300g离心5分钟。
5. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL PBS中，转移至1.5 mL离心管，以300g离心5分钟，随后弃去上清液。
6. 将细胞沉淀重悬于50 μL PBS中，加入荧光标记的抗体以鉴定目标细胞类型（如CD3、B220、CD8和CD4），以及负载目标肽段的荧光标记MHC-I四聚体（CD4 T细胞使用MHC-II四聚体），混匀后于4°C孵育30分钟。
7. 加入1 mL PBS，以300 g离心5分钟，将沉淀重悬于3 mL PBS中，并通过细胞筛（40或70 μm）过滤至另一离心管中。
8. 严格设置分选门进行FACSorting（见图1B）。

2. 体细胞核移植

体细胞核移植有几种实验方案。此处描述的方法利用处于第二次减数分裂中期（Metaphase-II）并被阻滞的卵母细胞，通过细胞松弛素B抑制第二次减数分裂，因此需要处于G0/G1期的供体细胞。

1. 卵母细胞的制备
   1. BDF1 背景的雌性小鼠在下午5点至7点之间通过腹腔注射每只5 IU PMS。
   2. 约47小时后，每只小鼠腹腔注射5 IU HCG。
   3. 同日hCG注射当天准备培养皿（KSOM-AA液滴覆油），用于卵母细胞培养，并置于37°C、5% CO₂培养箱中₂同时，通过填充汞来制备体细胞核移植（SCNT）所需的针头（去核用7μm针头，淋巴细胞核移植用4或5μm针头）。
   4. 安乐死小鼠，并在hCG注射后约13小时（大约上午8点）分离输卵管。将输卵管收集至1-2滴HCZB液滴中。
   5. 逐一将输卵管移入含有M2培养基与透明质酸酶的液滴中。用镊子小心地在输卵管上剪开切口，并将卵母细胞-卵丘细胞复合体移入液滴中。待所有卵母细胞-卵丘细胞复合体分离后，将培养皿置于37°C孵育。
   6. 孵育2-5分钟（具体时间取决于透明质酸酶的批次）后，收集卵母细胞，用HCZB洗涤，然后放入KSOM-AA液滴中培养。
2. 卵母细胞去核
   1. 使用培养皿的盖子制备SCNT板。安装显微镜和显微操作仪。
   2. 在开始去核前，用PVP清洗去核针（7 μm）。
   3. 去核操作时，将一组卵母细胞（10–30个）放入含有细胞松弛素B（5 μg/mL）的HZCB液滴中。在孵育期间（至少5分钟），将卵母细胞水平排列。
   4. 取一枚卵母细胞，将其置于持卵针前方，通过施加负压将卵母细胞固定在持卵针上。使用去核针将卵母细胞旋转，直至染色体-纺锤体复合物（CSC，常称为“细胞核”）位于3点钟位置。
   5. 使用压电脉冲小心穿透透明带，避免损伤卵母细胞。将针尖开口置于减数第二次分裂纺锤体附近并施加负压。细胞核应缓慢吸入针内，移出后膜结构应自行闭合。
   6. 将去核的卵母细胞转移回KSOM-AA液滴中，并多次洗涤。使用新的一组卵母细胞重复去核步骤。持续操作直至所有卵子完成去核，或直至约上午11点。
3. 核移植
   1. 进行核移植时，将去核针（7 μm）更换为核移植针（4 或 5 μm），并用 PVP 清洗。
   2. 将目标细胞（例如 CD8+ T 细胞）放入含聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的液滴中，充分混匀，孵育至少 10 分钟。
   3. 将一组去核卵母细胞（10–30个）放入含有细胞松弛素B（2.5 μg/mL）的HCZB液滴中。在孵育期间（至少5分钟），使用核移植针将卵母细胞水平排列。
   4. 从PVP-细胞悬液中吸取一个供体细胞，并反复吸入和推出，直至其外膜破裂（应可见膜碎片和细胞质）。如有必要，可施加压电脉冲。一旦细胞核被分离出来，将其在针管中略微上移，继续吸取细胞核，直至获得10–30个。
   5. 移至含有排列好的去核卵母细胞的液滴中。通过施加负压将一个卵母细胞固定在持卵针上。将核移植针（细胞核应远离针口）置于透明带旁，施加压电脉冲，直至针穿过透明带。小心地将一个细胞核移至针尖端，推动针进入卵母细胞，使针尖约有三分之二深入细胞内。施加轻微负压，使少量卵母细胞膜进入针内。
   6. 下一步非常关键，因为这是卵母细胞实际处于“开放”状态的唯一时刻。施加一次压电脉冲，通过施加正压将细胞核从针尖推出，小心回拉针头，使针尖约有三分之一仍位于卵母细胞内，然后施加负压并继续回拉针头，以使卵母细胞重新闭合。每个卵母细胞均需重复此步骤。
   7. 在一组卵母细胞全部完成注核后，将其洗涤并转入KSOM-AA培养基中培养。对所有卵母细胞重复此操作步骤。
   8. 在最后一组胚胎于KSOM-AA中培养至少30分钟后，将SCNT胚胎转移至含有SrCl2的无钙激活培养液滴中。
   9. 激活6小时后，检测假原核（PPN）阳性体细胞核移植（SCNT）胚胎的数量。随后将胚胎洗涤，并在KSOM-AA液滴中继续培养3.5天，直至发育至囊胚阶段。
   10. 可根据需要将选定的药物或化学物质（如曲古抑菌素A）加入激活和培养培养基中。

3. 胚胎干细胞的衍生

SCNT囊胚可用于移植到假孕雌性动物体内（也称为直接克隆或一步法克隆），或用于建立胚胎干细胞系（也称为间接克隆或两步法克隆）。由于生成胚胎干细胞的效率更高，我们选择两步法程序。如果研究人员希望进行直接克隆，可按照第5节所述，将囊胚直接移植到假孕雌性动物体内。

已有多种实验方案描述了胚胎干细胞的分离方法。此处所述为一种标准技术，该技术利用饲养层细胞和胎牛血清。

1. 核移植后的第二天，准备一个96-U孔板用于胚胎干细胞（ES细胞）的分离。
2. 向96-U孔板的每个孔中加入100 μL明胶，孵育至少10分钟，随后吸除。
3. 解冻饲养细胞，并用适当体积的ESD培养基重悬，例如，相当于25 cm²面积的饲养细胞重悬于10 mL ESD培养基中，然后将200 μL细胞悬液加入每个经明胶处理的孔中。
4. 将培养板放入培养箱，在37°C、5% CO₂条件下培养。
5. 3.5天后，胚胎应发育至囊胚阶段。
6. 通过在无菌细菌培养皿中加入数滴ES细胞培养基和酸性泰罗德液（acidic thyrode）来准备该培养皿。
7. 先将囊胚从KSOM-AA液滴转移至含常规ES细胞培养基的液滴中，并清洗两次。
8. 小心地将一组囊胚（5–10个）转移至一滴酸性泰罗德液中，并保持在此液滴中，直至透明带完全溶解。
9. 随后将囊胚转移至含有ES培养基的液滴中，清洗两次，再放入已涂有饲养层的96-U孔板中（每个孔放入一个囊胚）。
10. 将胚胎在培养箱中于37°C、5% CO₂条件下继续培养5–7天，期间避免扰动。此过程使胚胎有足够时间附着于饲养层并形成外延生长。
11. 准备24孔板，将饲养细胞以ESD培养基接种至每个孔中，例如，将相当于50 cm²面积的饲养细胞重悬于12 mL ESD培养基中，每孔加入500 μL细胞悬液。
12. 小心吸除含胚胎的96-U孔板中的ESD培养基，每孔用250 μL HEPES（或PBS）清洗两次，加入50 μL胰蛋白酶，在37°C孵育约5分钟。
13. 反复吹打数次，直至外延生长组织完全解离为单细胞悬液，转移至24孔板中，并在37°C、5% CO₂条件下培养。
14. 若胚胎干细胞分离成功，则在7–10天后应可见胚胎干细胞克隆。

4.囊胚注射

囊胚注射是生成各种转基因小鼠模型的常规技术。需要强调的是，囊胚注射以及随后向假孕雌鼠体内的移植操作必须把握好时机。

1. 按照第2.1节所述，使用PMS和HCG对雌性小鼠进行超排处理。在注射HCG后，将每只雌性小鼠与一只雄性小鼠合笼（每笼一只雌鼠和一只雄鼠）。
2. 次日检查雌鼠阴道栓情况。此日记为0.5 dpc（交配后天数）。
3. 随后按照第2.1节所述，从输卵管中分离受精胚胎，并在KSOM-AA培养基中继续培养3天。
4. 在囊胚注射当天（3.5 dpc）准备ES细胞。
5. 吸除ES细胞培养基，用Hepes（或PBS）洗涤两次，加入胰蛋白酶，于37°C孵育5分钟。
6. 用ES细胞培养基重悬消化后的细胞，接种至培养皿中，于37°C、5% CO₂条件下孵育45–60分钟，以减少饲养层细胞的数量（饲养层细胞贴壁速度比ES细胞快）。
7. 将细胞悬液通过细胞滤网（40或70 μm）转移至离心管中，以1000 rpm离心5分钟。
8. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500 μL ES培养基中，冰上保存备用。
9. 通过在无菌细菌培养皿盖内滴加含有PVP和HCZB的液滴，进行盖子的准备工作。
10. 通过注入汞、固定位置并用PVP清洗，制备一支15 μm的显微注射针。
11. 将一组囊胚（10–30个囊胚）放入含HCZB的液滴中，并将5–50 μL ES细胞悬液（根据浓度而定）加入另一含HCZB的液滴中。
12. 用注射针吸取50–100个ES细胞。
13. 将注射针移至含有囊胚的液滴中，将囊胚水平排列，并用持卵针通过施加负压固定其中一个囊胚。
14. 使用注射针旋转囊胚，使内细胞团（ICM）位于9点钟位置。
15. 将注射针置于3点钟位置，确保针尖无ES细胞残留，施加压电脉冲，直至注射针穿透透明带和滋养层进入囊胚腔。
16. 释放少量ES细胞（5–15个），使其附着于内细胞团（ICM）上。重复操作，直至该组所有囊胚均完成ES细胞注射。
17. 完成一组囊胚注射后，用KSOM-AA培养基洗涤两次，并将其保留在KSOM-AA液滴中，直至所有囊胚均完成注射。

5. 胚胎移植

将胚胎移植到假孕雌性动物体内是一项外科手术，必须非常谨慎地进行，并严格遵守研究人员所在机构的相关指南。

1. 麻醉雌性受体小鼠，剃除右下腹区域毛发，并进行消毒。
2. 使用剪刀切开皮肤，并将腹膜与皮肤分离。
3. 透过腹膜定位卵巢（红色斑点），并在靠近卵巢处切开腹膜。
4. 用镊子小心夹住输卵管，将子宫轻轻拉出。
5. 用连接口吸管的毛细管吸取约10个囊胚。
6. 用一把镊子固定子宫，用细针在子宫壁上刺一个小孔，将含有囊胚的毛细管插入子宫腔内。
7. 小心地将胚胎释放到子宫内，然后撤出毛细管。
8. 将子宫推回腹腔内。
9. 找到腹膜边缘，用数针缝合关闭。
10. 用数个皮肤钉闭合小鼠皮肤。
11. 术后镇痛：按每毫克体重5 μg的剂量给予卡洛芬（Carprofen）。

图1. B6CF1背景下的预定义T细胞体细胞核移植。由CD8+ T细胞及来自SCNT囊胚的胚胎干细胞所生成的胚胎的绝对数量与相对数量。

图2. 接受体细胞核移植胚胎干细胞注射的嵌合小鼠的代表性流式细胞术分析。门控区域及数字（占总CD8+ T细胞的百分比）表示嵌合小鼠中存在特异性CD8+ T细胞。

讨论

我们已证明，体细胞核移植技术（SCNT）可用于从具有预定义特异性的T细胞产生转基因小鼠。尽管此处未展示，该技术也应可用于从具有预定义特异性的B细胞生成转基因小鼠。

需要考虑的一个重要因素是小鼠的品系和性别，这些小鼠将被感染或免疫，并用于分离感兴趣的T细胞或B细胞。由于T细胞和B细胞的重编程效率通常很低，我们建议使用具有目标单倍型的F1杂交小鼠。由于供体细胞也决定后代的性别，因此我们推荐使用雄性小鼠的T细胞或B细胞。这意味着只有雄性嵌合小鼠才能通过生殖系传递TCR或BCR，而雄性小鼠在繁殖上更简便且速度更快。

综上所述，我们认为通过体细胞核移植（SCNT）进行的表观遗传重编程是一种强大的工具，可用于生成一种新型的小鼠模型，这将对免疫学领域带来显著优势。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
红细胞裂解缓冲液	Sigma-Aldrich	R7757
细胞滤筛	BD 生物科学	参考编号 352340
孕马血清（PMS）	Calbiochem	367222
人绒毛膜促性腺激素（HCG）	Calbiochem	230734
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H4272	IV-S型
KSOM-AA	EMD Millipore	MR-106-D
HCZB	EMD Millipore	MR-173-D	定制培养基
用于激活的无钙培养基	EMD Millipore	MR-174-D	定制培养基
SrCl2	Sigma-Aldrich	255521	100 mM = 10倍
AlbuMAX I	GIBCO，隶属于 Life Technologies	11020-021
聚乙烯吡咯烷酮	MP Biomedicals	102787	使用HCZB配制10%溶液，并加入0.1% AlbuMAX I
细胞松弛素B	Sigma-Aldrich	C6762	500μg/ml = 100倍
曲古抑菌素 A	Sigma-Aldrich	T8552	5 mM = 1000倍
矿物油	Sigma-Aldrich	M5310
持针	Humagen	MPH-SM-30
注射针和转移针	Humagen	4-15, 7-15, 15-15
口吸移液管	Sigma-Aldrich	A5177
剪刀	Fine Science Tools	14088-10	或类似物
镊子	精细科学工具	11251-10	或类似物
伤口缝合夹施加器	BD 生物科学	427630
伤口夹	BD 生物科学	427630
缝合	Ethicon Inc.	K871H
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
FBS	Hyclone	SH30071.03	15%
青霉素/链霉素	Lonza Inc.	17-602E	100x
谷氨酰胺	MP Biomedicals	101806	200 mM = 100倍
非必需氨基酸	GIBCO，隶属于 Life Technologies	11140050	100x
β巯基–乙醇	GIBCO，隶属于 Life Technologies	21985-023	5μ500毫升中的升
LIF	EMD Millipore	ESG1106	1000x
MEK抑制剂	细胞信号技术公司	9900L	仅用于 ES 细胞分离时，加入 ES 培养基中（终浓度 50μM)