El método de cultivo de embriones de roedores enteros utilizando el sistema de tipo de botella rotador Cultura
Summary
Toda técnica de cultivo de embriones de ratón nos permite la cultura y embriones de rata<em> Ex vivo</em> Condición durante períodos limitados correspondientes a las etapas mitad de la gestación. En este protocolo de video, demostramos nuestros procedimientos estándar de cultivo de embriones de ratas después de todo E12.5 utilizando el sistema de botella de los rotadores, el tipo de cultivo.
Abstract
Toda una cultura de embriones (WEC) técnica ha sido desarrollada en 1950 por nuevas y sus colegas, y se aplica para la biología del desarrollo 1. Aunque el desarrollo y el crecimiento de los embriones de mamíferos son críticamente dependientes de la función de la placenta, la técnica del CME de ratón nos permite la cultura y la condición de embriones de rata ex vivo durante períodos limitados correspondientes a las etapas mitad de la gestación durante el día embrionario (E) de 6.5 E12.5 en el ratón o E8.5-E14.5 en la rata 2, 3, 4. En WEC, podemos directamente de destino deseado áreas de embriones utilizando finos capilares de vidrio porque los embriones pueden ser manipulados bajo el microscopio. Por lo tanto, el CME de roedores es una técnica muy útil cuando queremos estudiar los procesos dinámicos de desarrollo de los embriones de mamíferos postimplanted. Hasta la fecha, varios tipos de sistemas de CME han sido desarrollados 1. Entre ellos, el sistema rotatorio botella-el tipo de cultivo es el más popular y apto para el cultivo prolongado de embriones en mitad de la gestación, es decir, después de E9.5 y E11.5 en el ratón y la rata, respectivamente 1. En este protocolo de video, demostramos nuestros procedimientos estándar de WEC ratas después de E12.5 con un modelo perfeccionado del sistema original de los rotadores, que fue diseñado por nuevos y Cockroft 5, 6, y la introducción de diversas aplicaciones de la técnica del CME para los estudios en mamíferos de desarrollo la biología.
Protocol
Discussion
Hay dos pasos críticos en el CME de roedores para el éxito. En primer lugar, el procedimiento de disección debe ser precisa, no para los embriones de los daños, especialmente en los vasos sanguíneos. En segundo lugar, el procedimiento debe ser lo más rápido posible porque el oxígeno y los nutrientes no son suministrados a través de la placenta después del aislamiento del útero. Esto es crítico para mayores embriones. En el caso de las ratas después de WEC E12.5, debemos transferir embriones disecados en fra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Sr. Hajime Ichijo por los consejos de grabación en vídeo y útil para la edición de vídeo. También agradecemos a Drs.Yuji Tsunekawa y Yoshizaki Kaichi de tipo asistente para la grabación en vídeo. Este trabajo es apoyado por KAKENHI en B para jóvenes científicos y la ciencia del cerebro áreas prioritarias-molecular de MEXT de Japón. Queremos agradecer el apoyo de Global COE Programa "Centro de investigación básica y traslacional de la Ciencia del Cerebro Global" de MEXT de Japón y la investigación central para la Ciencia Evolutiva y de la Tecnología (CREST) de la Ciencia y la Corporación Japonesa de Ciencia Tecnología japonesa y Tecnología (JST) .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comment |
| Setting up WEC | ||||
| WEC system (10-0310) | Tool | Ikemoto Rika | 010-0310 | Another small model is also available. |
| Silicon plug without a hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas mixture cylinder | Tool | Nikko Sanso | – | Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order. |
| Gas regulator | Tool | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 μm filter Millex GS | Tool | Millipore | SLGS033SS | |
| Anesthesia and isolation of the uterus | ||||
| Large scissors | Tool | Napox | B-7H | |
| Forceps | Tool | Napox | A-3-2 | |
| Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm) |
Tool | Iwaki | SH90-15 | Deep-type dish is the best for dissection. |
| Isoflurane | Reagent | Abbott | B506 | For anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Reagent | Schering-Plough Animal Health | – | For anesthesia |
| Tyrode’s saline | Reagent | – | – | According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C. |
| Timed-pregnant Sprague-Dawley rat | Animal | Charles Rivers Laboratories Japan | – | |
| Preparation of culture medium | ||||
| Culture glass bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Disposal culture bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon plug with hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminum foil | Tool | Any company | – | |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-26 | For culture bottles |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-14A | For silicon plugs |
| 0.45 μm filter Millex HA | Tool | Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml conical tube | Tool | Becton Dickinson | 352070 | |
| 100 ml beaker | Tool | Iwaki | TE-32 | |
| Rat IC serum | Reagent | Charles Rivers Laboratories Japan | – | Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-Glucose | Reagent | Wako | 041-00595 | |
| Antibiotic-antimyotic liquid | Reagent | Gibco | 15240 | |
| Dissection of embryos | ||||
| Ophthalmic straight scissors | Tool | Napox | MB50-7 | For cutting the uterine wall |
| Ophthalmic curved scissors | Tool | Napox | MB54-2 | For cutting the yolk sac |
| Forceps #5 | Tool | Vigor | T6715 | |
| Forceps #5F | Tool | Regine | T6819 | |
| Glass pipette | Tool | – | – | Made by hand using Pasteur pipette. |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-4 | For glass pipettes |
| Binocular microscope | Tool | Leica | Mz7s | |
| Light | Tool | Leica | CLS 150XD | |
| Oil stone | Tool | Uchida Yoko | 833-2000 | For sharpening of forceps |
| Machine oil | Tool | Uchida Yoko | 835-0000 | For sharpening of forceps |
References
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