角膜共焦显微镜是一种无创临床技术，可用于量化C纤维损伤，从而诊断神经病变程度逐渐加重的患者并对其进行分层。
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方法文章
角膜共聚焦显微镜：一种用于量化周围神经病变中小纤维病理变化的新型无创技术
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
准确量化周围神经病变对于识别高风险患者、预测病情恶化以及评估新疗法至关重要。传统方法通过评估神经功能缺损、电生理学以及定量感觉测试来量化功能改变以检测神经病变。然而，最早期的损伤往往发生在细小神经纤维，而这些检测方法主要评估的是粗大纤维功能障碍，且在显示神经再生与修复方面能力有限。目前唯一能够直接观察无髓鞘神经纤维损伤与修复的技术是通过电子显微镜检查腓肠神经活检和皮肤钻孔活检。然而，这两种方法均为侵入性操作，且需要耗时的实验室处理过程以及高度专业化的技术。角膜共聚焦显微镜是一种非侵入性的临床技术，可提供 体内 角膜神经纤维成像。我们已证实，在糖尿病患者中，角膜神经损伤早于皮肤活检中表皮内神经纤维的丢失，并且能够对胰腺移植后神经病变严重程度的分层及神经修复情况进行评估。我们还证实了特发性小纤维神经病和法布里病中存在神经损伤。
方案
引言：
准确量化周围神经病变对于识别高风险患者、预测病情恶化以及评估新疗法至关重要。传统方法通过评估神经功能缺损、电生理学检查及定量感觉测试来量化功能改变以检测神经病变。然而，最早期的损伤往往发生在细小神经纤维，而这些检查主要评估的是粗大纤维功能障碍，且在显示神经再生与修复方面能力有限。目前唯一能够直接观察无髓鞘神经纤维损伤与修复的技术是通过电子显微镜进行腓肠神经活检和皮肤钻孔活检。然而，这两种方法均为侵入性操作，且需要耗时的实验室处理过程以及较高的专业技术水平。角膜共聚焦显微镜是一种非侵入性的临床技术，可提供 体内 角膜神经纤维成像
HRT III- 罗斯托克角膜模块（RCM）
操作手册
1. 相机的准备
使用HRT进行检查的初始步骤是准备物镜尖端。
- 首先，在激光扫描相机的物镜筒上将折射率设置为 +12 屈光度，然后将相机调整至最低位置。
- 在镜头尖端滴加一滴大小均匀、无气泡、豌豆大小的透明质酸钠凝胶（Viscotears）。
- 从无菌容器中取出一个 TomoCap，并将其套在镜头尖端，使凝胶在物镜与 TomoCap 之间形成弯月面。尽可能将 TomoCap 推到底座上。安装过程中注意不要触碰 TomoCap 的前表面。
图 1. 物镜尖端的准备（上图）以及涂抹透明质酸钠凝胶（下图）和安装 TomoCap 的过程。 - 将激光扫描相机沿相机支架尽可能向后移动。
- TomoCap 的内表面和外表面均会呈现明亮的激光反射。应调节焦平面调节旋钮，直至观察到明亮的反射光斑，表明镜头焦点已位于 TomoCap 前表面之内。此时焦点位置显示的深度值应在 -150 μm 至 +150 μm 之间。
- 将深度设置重置为零。
图 2. 焦平面的调节。
2. 患者准备
使用一滴0.4%盐酸倍诺昔明对受试者的眼睛进行表面麻醉，并在眼球前部使用Viscotears润滑。
让受试者舒适地坐下，下巴置于下巴托上，并要求其前额紧贴额带。
图3. 患者的准备工作
3. 调整相机位置
检查时，可指导患者用未检查的眼睛注视外部的固定光源，这样可使检查更为方便。由于显微镜头部结构紧凑，不会遮挡受试者的对侧眼睛，因此可使用远距离目标进行检查。
图 4. 角膜模块的物镜镜头。
- 将CCD相机定位，使其光轴与激光扫描相机的光轴相互垂直。成像右眼时，相机应置于患者右侧，反之亦然。
在此位置，您应在CCD相机的实时图像中心看到TomoCap的前表面。 - 将激光扫描相机向患者移动，直至患者角膜与TomoCap之间的距离约为5至10 mm。然后通过相机支架上的黑色旋钮上下、左右调节激光扫描相机，使TomoCap位于患者角膜中央。此时可检查红色激光光点是否位于角膜中心；为进行精细调节，请观察角膜表面激光束的反射光，该反射光可在CCD相机图像中看到。此反射光必须精确地位于角膜前极。
图5. 将激光束对准角膜前极以获取中央角膜图像。 - 让患者尽可能睁大眼睛。缓慢将激光扫描相机向前移动，直至TomoCap接触患者的角膜。如需校正激光扫描相机的位置，应先将其移离患者，进行校正后再重新向前移动，直至接触角膜。
图6. 展示TomoCap与角膜之间形成的薄凝胶桥。 - 摄像头与角膜之间的接触越轻越好。在最佳调整状态下，TomoCap与角膜之间会形成一层薄薄的凝胶桥，可在CCD相机的实时图像中观察到。
如果按压 TomoCap 或将角膜移至过于靠近摄像头的位置，则通过 CCD 相机的实时图像可观察到角膜受压并呈现扁平状。此外，在获取的图像中会出现一条显示压力的线，因此请勿对角膜施加过大的压力。一旦建立接触，切勿移动头托的位置，以避免角膜在 TomoCap 上滑动。
图7. （左）由于TomoCap对角膜施加过压而在角膜上形成的条纹外观；（右）无过压情况下正常外观的图像。
4. 检查患者
选定视野后，打开HRT III激光相机，屏幕上将出现图像采集窗口。使用CCD图像将TomoCap和激光光束定位在患者的角膜上，随后即可开始所选模式的检查。
图8. 图像采集过程中显示器上的观察模式。
采集模式
在单幅图像模式下，每次按下脚踏开关时都会采集并存储一幅单独的图像。我们使用此模式来获取角膜全层的图像，包括角膜中央的前弹力层（Bowman层）。在采集到足够数量的图像后，可以尝试其他模式，如序列模式和体积模式。
图9. 不同图像采集模式选择的显示界面。
通过序列扫描，可获取最多100张图像的序列，帧率可调。您可在每秒30帧至每秒1帧（fps）之间选择帧率，根据此模式，可获取时长为3至100秒的视频。
在体积扫描模式下，相机将自动连续获取40个不同焦平面的图像序列。使用“400 μm视场”场镜时，最大扫描深度可达85 μm，相邻两幅图像之间的焦距间隔约为2.1 μm。
经过几次扫描后，可通过将上皮细胞层调至焦点，然后点击“重置”按钮将深度值设为0，来改变镜头的焦平面，从而测量角膜细胞层相对于角膜表面的深度。
在本研究中，我们从角膜中央不同深度获取图像。因此，我们不将扫描激光相机在角膜水平或垂直方向移动，而是仅前后移动，从同一角膜位置获取鲍曼层（Bowman's layer）各个深度的图像。每张图像之间的距离约为 1 μm；因此，若鲍曼层的深度为 10 μm，则可获得 10 张图像。但在最终分析时，我们选择图像间距约为 2–3 μm 的图像。
检查完成后，通过点击采集窗口中的相机电源按钮关闭相机。应告知患者在局部麻醉作用消退之前不要揉擦眼睛。作为预防措施，建议在检查结束后对患者的角膜进行裂隙灯检查。
从相机上取下TomoCap并丢弃，然后用蘸有蒸馏水的棉签清洁显微镜镜头。
5. 分析一次检查
a. 选择帧
为了查看和分析现有的检查结果，必须在数据库窗口中选择相应的患者记录。图像查看窗口提供了所选患者已有角膜检查的概览。在不同日期进行的检查分别存储在不同的就诊标签页中。在海德堡眼科专家系统（Heidelberg Eye Explorer）的图像查看窗口中，HRT III 角膜就诊标签页内，三种不同的扫描类型由三个不同的图标表示。
查看角膜图像时，双击相应的图像图标，“显示”功能将打开以下窗口：
图10. 检查后显示所有采集的图像。
图11. 导出前选定图像的显示，包含眼底的CCD相机视图，以显示正确的对准状态。
要导出适合进一步分析的图像，请单击工具栏上的“Export”，然后选择要保存图像的文件夹。
我们获取并采集每位患者角膜各层的图像，但由于本研究主要关注鲍曼层和角膜神经，因此仅分析来自该层的图像。针对每位受试者，我们从角膜不同深度的鲍曼层中选取5至6帧图像。
图12. 健康受试者角膜各层的显示。
通常从角膜中央不同深度的鲍曼层随机选取平均5-6帧图像，用于定量测量和分析。
b. 分析图像
为了分析使用HRT III从角膜中央的鲍曼层获取的图像，我们采用本课题组开发的专用软件“CCM Image Analysis Tools v 0.6”。
该软件可测量角膜神经的四个主要参数：
- 神经纤维密度（NFD），定义为每视野主神经的数量。
- 神经分支密度（NBD），即每视野主分支的数量。
- 神经纤维长度（NFL），即每视野所有神经的总长度。
- 神经纤维曲度（NFT），指每视野主神经的弯曲程度。
要打开CCM图像，请转到文件 > 打开。
- 图像加载后，其大小和类型将显示在控制面板左上角的“图像信息框”中。
- 图像信息的编辑栏中会显示默认的比例尺。如果实际比例尺不同，请修改编辑栏中的数值。
- 要开始分析图像，请在控制面板右上角的“度量框”中选择您要测量的参数。
- 在页面底部的结果框中，NFD 和 NBD 的结果以绝对数值显示，NFL 以毫米（mm）显示，扭曲度则以扭曲系数（TC）表示。
- 但将结果导出至 Excel 表格后，NFD 和 NBD 的结果将以个数/平方毫米（no/mm2）表示，NFL 以毫米/平方毫米（mm/mm2）表示。
- 为此，在完成测量后，点击“添加测量”，然后进入“文件”>“另存为”，再用 Excel 打开保存的结果文件。
图13. 使用“CCM图像分析工具”在分析软件中显示角膜神经图像及其追踪结果。
6. 代表性结果：
我们已证实，随着糖尿病神经病变严重程度的增加，角膜神经变性呈进行性加重1，且糖尿病早期即出现神经损伤，早于皮肤活检中表皮内神经纤维的丧失2，同时在糖尿病患者中，胰腺移植后神经病变严重程度可分层，并观察到神经修复情况3。我们还证实了特发性小纤维神经病变4和法布里病5中存在神经损伤。
图14. 使用HRT III对角膜鲍曼层进行的角膜共聚焦显微镜成像：（a）健康对照者与（b）患有神经病变及严重神经损伤的患者对比。
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讨论
角膜共焦显微镜（CCM）是一种无创的临床技术，可用于检测早期神经损伤，并量化包括糖尿病、法布里病及特发性小纤维神经病（ISFN）在内的周围神经病变中的小纤维病理改变。该技术在临床上的即时应用标志着我们在诊断糖尿病神经病变及其他周围神经病变、追踪疾病进展以及评估治疗反应能力方面迈出了巨大的一步，并将对患者的临床结局产生直接的积极影响。
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披露
图4 - 6：由Heidelberg Engineering提供
致谢
本工作由国际青少年糖尿病研究基金会（资助号 17-2008-1031）和美国国立卫生研究院（资助号 1R01DK077903-01A1）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HRT III CCM 机器 - 罗斯托克角膜模块 | Heidelberg Engineering | ||
| CCM 图像分析软件 v0.6 | 曼彻斯特大学 |
参考文献
- Abbott, C. A., Kallinikos, P., Marshall, A., Finnigan, J., Morgan, P., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Test to Diagnose and Assess Progression of Human Diabetic Neuropathy. Diabetes Care. 33, 1792-1797 (2010).
- Quattrini, C., Tavakoli, M., Jeziorska, M., Kallinikos, P., Tesfaye, S., Marshall, A., Finnigan, J., Boulton, A. J. M., Efron, N., Malik, R. A. Surrogate Markers of Small Fiber Damage in Human Diabetic Neuropathy. Diabetes. 56, 2148-2154 (2007).
- Mehra, S., Tavakoli, M., Efron, N., Boulton, A. J. M., Augustine, T., Malik, R. A. Corneal Confocal Microscopy Detects Early Nerve Regeneration After Pancreas Transplantation in Patients with Type 1 Diabetes. Diabetes Care. 30, 2608-2612 (2007).
- Tavakoli, M., Marshall, A., Pitceathly, R., Fadavi, H., Gow, D., Roberts, M. E., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. Corneal confocal microscopy: A novel means to detect nerve fibre damage in patients with impaired glucose tolerance and idiopathic small fibre neuropathy. Experimental Neurology. 223, 245-250 (2010).
- Tavakoli, M., Marshall, A., Thompson, L., Kenny, M., Waldek, S., Efron, N., Malik, R. A. Corneal confocal microscopy: A novel technique to detect small-fibre neuropathy in patients with Fabry disease. Muscle & Nerve. 40, 976-984 (2009).
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重印与许可
