人血液细胞集落形成细胞（CFC）检测

摘要

集落形成细胞（CFC）实验是一种体外实验，其中造血祖细胞在半固体培养基中形成集落。通过集落形态、细胞形态以及流式细胞术相结合的方法，评估祖细胞在不同造血谱系中增殖和分化的能力。

摘要

人类造血干/祖细胞通常来源于骨髓、脐带血或外周血，用于研究造血过程及白血病的发生。这些细胞具有分化为淋巴细胞系和髓系的能力。集落形成细胞（CFC）实验通过造血祖细胞在半固体培养基中形成集落的能力，来研究其增殖与分化模式。通过固定数量的起始细胞所形成的集落数量和形态，可初步评估祖细胞的增殖与分化潜能。可从单个集落或整块培养板中收集细胞，进一步通过流式细胞术以及吉姆萨染色涂片的形态学评估，分析其细胞数量和分化状态。该实验适用于评估髓系但不适用于淋巴系的分化能力。此处所指的“髓系”采用广义定义，包括粒细胞系、单核细胞系、红细胞系和巨核细胞系。

我们已采用该检测方法评估癌基因对源自外周血的原代人CD34+细胞分化的影响。为此，细胞被转导携带对照逆转录病毒载体或表达目标癌基因（本例中为NUP98-HOXA9）的载体。我们使用一种常用的逆转录病毒载体MSCV-IRES-GFP，其表达一种双顺反子mRNA，可同时产生目标基因和GFP标记物。在逆转录病毒转导前，细胞需在细胞因子存在条件下培养两天以进行预激活。再经过两天后，通过荧光激活细胞分选（FACS）分离GFP+细胞，并将其与含细胞因子的甲基纤维素半固体培养基混合，孵育至菌落出现在培养基表面，通常为14天。记录菌落的数量和形态。随后从培养板中取出细胞，洗涤、计数，并进行流式细胞术分析和形态学检查。利用针对造血过程中表达的细胞表面标志物的特异性抗体进行流式细胞术分析，可提供有关细胞谱系及成熟阶段的信息。经Wright-Giemsa染色后在显微镜下观察单个细胞的形态学特征，可进一步获得谱系和成熟状态的相关信息。将转导了对照空载体的细胞与转导了癌基因的细胞进行比较，可揭示该癌基因对造血分化的效应。

方案

1. 试剂的制备

1. 根据制造商说明书，配制无菌的 Fms 相关酪氨酸激酶 3（FLT-3）配体、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、干细胞因子（SCF）、血小板生成素（TPO）、白细胞介素（IL）-3 和 IL-6 的 1000 倍储存液。同时根据制造商说明书配制无菌的 Retronectin 储存液（1 mg/ml）。将上述储存液分装成小份，保存于 -20 °C，避免反复冻融。
2. 配制含 2% FBS 的 IMDM 溶液。
3. 配制完全 IMDM 培养基，终浓度为 20% FBS、2 mM 谷氨酰胺、100 单位/ml 青霉素/链霉素（PS）。使用前现加以下细胞因子：100 ng/ml FLT-3 配体、20 ng/ml GM-CSF、100 ng/ml SCF、100 ng/ml TPO、50 ng/ml IL-3 和 100 ng/ml IL-6。
4. 配制 HBSS（无钙、无镁，不含酚红）中的 1% BSA 溶液，以及 D-PBS（无钙、无镁）中的 2% BSA 溶液。使用 0.22 μm 注射器滤器过滤除菌，4 °C 保存。
5. 配制 HBSS 中的 0.02% EDTA 溶液，4 °C 保存。
6. 制备编码目标 DNA 的 GaLV 假型逆转病毒，并分装后于 -80 °C 保存。此步骤不在本文范围内，但其他文献已有描述（1-3）。

吉姆萨染....

讨论

集落形成细胞（CFC）检测已被广泛用于确定造血祖细胞的增殖和分化模式，并研究癌基因的作用（4, 5）。与液体培养相比，CFC检测的优势在于它是一种克隆性检测，每个集落均来源于单个祖细胞，因此可单独挑取集落进行后续分析。CFC检测的局限性在于其无法有效检测更原始的祖细胞或造血干细胞；这类细胞通常通过长期培养起始细胞（LTC-IC）检测来鉴定（6, 7）。本文所述实验表明，与急性髓系白血病（AML）相关的癌基因NUP98-HOXA9可抑制髓系和红系成熟，并导致红系增生（1, 3）。

由于甲基纤维素培养基培养时间相对较长，且集落形成细胞（CFC）培养基中不含抗生素，因此在分选期间及分选后防止细胞培养污染至关重要。任何轻微的细菌或真菌污染都会导致培养体系被完全破坏。流式细胞术分析和细胞形态学判读需要经验积累，建议咨询经过培训的专业人员。应仅使用经过预先筛选、确认适用于人原代髓系祖细胞的胎牛血清（FBS）；我们常规使用的产品已在试剂表中列出。基于甲基纤维素的CFC培养基黏度很高，在操作时需特别小心，确保充分混匀并在倒入培养板前去除气泡。将CFC培养板置于较大的培养皿中，并同时放置盛.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IMDM	Life Technologies	12440
FBS	干细胞技术	06150
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030
青霉素/链霉素（PS）	Life Technologies	15140
FLT-3配体	PeproTech 公司	300-19
GM-CSF	PeproTech Inc	300-03
SCF	PeproTech 公司	300-07
TPO	PeproTech 公司	300-18
IL3	PeproTech 公司	200-03
IL6	PeproTech Inc	200-06
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7030
EDTA	Fisher Scientific	BP118
Retronectin	Takara Bio 公司	T100A
HBSS	Life Technologies	14175
PBS	Life Technologies	14200
0.4% 台盼蓝溶液	Sigma-Aldrich	T8154
Methocult GF+ H4435	干细胞技术	04445
人源甲基纤维素富集培养基	R&D Systems	HSC005
瑞氏-吉姆萨染色	Harleco	64571
磷酸盐缓冲液，pH 6.4 - Giordano 配方	Ricca Chemical Company	1450
甲醇	Fisher Scientific	A412-4
Cytoseal 60	赛默飞世尔科技公司	8310
正常小鼠血清	Rockland Immunochemicals	D208
抗人 CD11b 藻红蛋白–藻红蛋白偶联的	BD 生物科学	555388
抗人 CD33 别藻红蛋白偶联物	BD 生物科学	551378
抗人 CD45 藻红蛋白–rythrin-Cy7-偶联物	BD Biosciences	557748
抗人CD71藻红蛋白–藻红蛋白偶联的	BD 生物科学	555537
抗人CD235a藻红蛋白偶联物	BD 生物科学	551336
抗人 CD45 藻红蛋白–rythrin-Cy7-偶联	BD Biosciences	557748
24孔未处理组织培养板	BD Biosciences	35-1147
30 mm 未处理培养皿	干细胞技术	27150
100 毫米细胞培养皿	Fisher Scientific	08-757-12
网格化评分培养皿	干细胞技术	27500
15 ml 离心管	BD 生物科学	35-2097
50 ml 离心管	BD 生物科学	35-2070
3 ml 注射器	干细胞技术	28240
16号钝端，1½ 英寸针头	干细胞技术	28110
50 μm CellTrics 细胞滤膜	Partec	04-004-2327
血细胞计数板	Fisher Scientific	0267110
TPX 样品室	赛默飞世尔科技公司	A78710018
Fisherbrand Superfrost/Plus 显微镜载玻片，预清洁	Fisher Scientific	12-550-15
Shandon 滤纸卡	赛默飞世尔科技公司	5991022
Shandon 细胞离心涂片机载玻片夹	赛默飞世尔科技公司	59920063
Shandon全自动染色系统100	赛默飞世尔科技公司	100
Kimwipes	金佰利公司	34155
1 μm 滤纸	VWR 国际	28307-134
倒置显微镜	尼康仪器公司	Diaphot
显微镜相机	尼康仪器公司	DS-F11
显微镜	奥林巴斯株式会社	BX51
显微镜相机	奥林巴斯株式会社	DP71
扫描仪	Microtek	Scanmaker 4
涡旋混合器	Fisher Scientific	12-812
组织培养箱	Sanyo	MCO-18AIC
细胞离心涂片	Shandon, Inc.	Cytospin 2
台式离心机	Eppendorf	5810-R
水纯化系统	Barnstead	纳米纯钻