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方法文章

成年北极地松鼠海马神经干细胞的生长与分化

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DOI：

10.3791/2199

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2011年1月7日

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1Alaska Basic Neuroscience Program, Institute of Arctic Biology, University of Alaska at Fairbanks, 2Department Biochemistry, Hood College, 3Department of Cell Biology, Neuronascent, Inc., 4Research and Development, Neuronascent, Inc.

本文内容

摘要

神经干细胞取自成年非冬眠期一年生北极地松鼠（AGS）的海马体。这些神经干细胞可通过多次传代进行扩增，并可分化并维持为神经元与胶质细胞比例接近50:50的培养体系。

摘要

北极地松鼠（Urocitellus parryii，AGS）在冬眠期间能够将核心体温降至接近或低于冰点，这一能力在动物中十分独特 1这些动物对脑缺血性损伤也具有抵抗能力 体内 2,3 氧糖剥夺 体外 4,5这些独特的特性促使研究人员分离出AGS神经元，以研究其内在的神经元特征，从而揭示AGS神经元能够抵抗缺血及极低温所致损伤和细胞死亡的潜在机制。鉴定赋予这些细胞独特性质的蛋白质或基因靶点，将有助于发现针对多种缺血性疾病的有效治疗策略，并推动耐寒机制的研究。成年AGS海马体中含有持续增殖的神经干细胞，使其在体外培养中易于扩增。本文描述了研究人员可利用这些干细胞及其分化神经元开展多种研究的方法。通过严格遵循这些操作步骤，AGS神经干细胞可连续传代两次或以上，并可分化为TUJ1阳性神经元比例较高（约50%）的培养体系，且无需使用有毒化学物质来抑制细胞增殖。缺血可诱导神经发生 6 并通过MEK/ERK和PI3K/Akt存活信号通路进行的神经发生有助于缺血耐受 体内7 和 体外 8 (凯勒赫-安德森，德鲁 等，正在准备中）。利用这些方法中的一种或多种，可从多个方面进一步表征这些独特的神经细胞。

方案

1. AGS 神经干细胞及培养基制备

  1. 成人北极地松鼠（Arctic ground squirrel, AGS）神经干细胞此前已通过所述方法分离9，现可作为冻存管形式商业化获得。细胞通过含干冰的隔热包装进行隔夜运输，以确保细胞保持在冻存状态。为维持细胞完整性，收到后应立即开箱，并储存于低于 -150°C 的环境或液氮杜瓦瓶的气相中。
  2. 通过向 95 mL agsNSC 基础培养基中加入 5 mL FBS（LS-1012），配制含 5% FBS 的 agsNSC 基础培养基。
  3. 通过向 50 mL agsNSC 基础培养基中加入 500 μL B-27 补充剂（Invitrogen），配制 agsNSC 扩增培养基。将剩余的 B27 分装为每份 1 mL 的等分试样，储存于 -20°C 直至使用。
  4. 将 25 mL 含 5% FBS 的 agsNSC 基础培养基和 20 mL agsNSC 扩增培养基置于 37°C 水浴中预热。
  5. 使用多聚-L-鸟氨酸包被用于扩增的培养瓶
    1. 解冻多聚-L-鸟氨酸（10 μg/mL）工作液。解冻后可在 2–8°C 条件下储存长达一个月。
    2. 向一个带透气盖的 T-75 培养瓶中加入 8 mL 多聚-L-鸟氨酸工作液，并将溶液均匀覆盖整个培养表面。（若使用其他培养容器，请相应调整工作液体积。每 10 cm2 培养面积使用 0.5–1.0 mL 多聚-L-鸟氨酸工作液。）
    3. 将培养瓶在 37°C 条件下孵育至少 24 小时。（建议使用不额外添加 CO2 的培养箱孵育多聚-L-鸟氨酸包被的培养容器。）包被后的培养瓶可在培养箱中储存长达两周。
    4. 使用前，吸除培养瓶中的多聚-L-鸟氨酸工作液，并用无菌组织培养级水清洗两次。使用前将液体吸除至培养瓶接近干燥状态。
  6. 从杜瓦瓶中取出一支冻存管，检查管盖是否密封牢固。手持管体上部，将下半部分浸入 37°C 水浴中约 60–90 秒，直至冻存管几乎完全解冻，仅残留少量冰晶。为避免潜在污染，保持管盖不接触水。切勿过度解冻，以免损伤细胞。
  7. 用 70% 乙醇或异丙醇喷洒冻存管外表面，然后将冻存管放入生物安全柜中。小心打开管盖，避免污染或液体飞溅。
  8. 使用无菌移液器向冻存管中加入 1 mL 含 5% FBS 的 agsNSC 基础培养基，轻柔重悬细胞。将重悬后的细胞转移至含有 25 mL 预热的含 5% FBS 的 agsNSC 基础培养基的 50 mL 离心管中。
  9. 用稀释后的细胞悬液冲洗冻存管一次。以 150 × g 离心 6 分钟。为获得最佳效果，应根据所用离心机型号单独计算离心速度。
  10. 在细胞离心过程中，向已干燥的多聚-L-鸟氨酸包被的 T-75 培养瓶中加入 10 mL agsNSC 扩增培养基，并加入 40 μL rh FGF-basic（终浓度 40 ng/mL）。离心结束后，小心吸除上清液，避免吸走细胞沉淀。用 10 mL agsNSC 扩增培养基重悬细胞，然后将重悬的细胞转移至 T-75 培养瓶的培养基中。
  11. 轻柔地左右摇动培养容器，使细胞在容器内均匀分布。
  12. 将接种后的培养容器置于 37°C、5% CO2 的培养箱中。细胞应在接种后两小时内贴壁并开始形成突起。若细胞仍漂浮于培养基中并聚集成团，则将细胞在含 5% FBS 的培养基中离心，并使用新鲜培养基和培养瓶重复步骤 1.8–1.10。

2. AgsNSC 的扩增

  1. 细胞解冻并接种后约两天（~48 小时），应使用 20 mL agsNSC 扩增培养基并添加 40 μL rh FGF-basic 进行完全换液。
  2. 接种后次日，向培养瓶中添加 40 μL rh FGF-basic。接种后第三或第四天，当细胞融合度达到 75–80% 时，即可进行胰酶消化。不建议在接种后超过 4 天继续培养未分化干细胞，因为延长培养时间将导致细胞开始向神经元分化，而在第 3 步进行胰酶消化时可能损伤这些神经元。rh FGF-basic 可在 4°C 下保存长达一周并保持活性；若需更长时间，也可在 -20°C 再进行一次冻融循环。

3. 细胞胰酶消化

  1. agsNSC 应在接种后 3 到 4 天进行传代。如果需要再次扩增 agsNSC，请在传代前 24 小时至一周内准备好经多聚-L-鸟氨酸包被的培养瓶。
  2. 从培养容器中吸除培养基。根据培养表面积，每 75 cm2 加入 2.5 mL 的 0.05% 胰蛋白酶/0.02% EDTA（CM-0017）。轻轻晃动，确保所有细胞均被胰蛋白酶/EDTA 覆盖。通常在 60 秒内细胞即开始从表面脱落，具体时间取决于细胞融合度。避免过度消化，以免损伤细胞。轻轻敲击培养容器的多个侧面可促进细胞脱落。
  3. 待细胞完全脱落后，向培养瓶中加入 10 mL agsNSC 基础培养基 + 5% FBS。轻轻晃动，确保胰蛋白酶溶液被充分中和。采用无菌实验操作技术，用移液器将细胞转移至含有 10 mL agsNSC 基础培养基 + 5% FBS 的无菌离心管中。再用额外的 10 mL agsNSC 基础培养基 + 5% FBS 洗涤培养瓶一次，并将洗涤液与第一次的收集液合并。
  4. 按照上述方法，以 150 × g 离心 6 分钟。离心后，细胞应形成完整且松散的沉淀。吸除中和后的胰蛋白酶和培养基，用 10 mL（每 T-75 培养瓶）预温的 agsNSC 基础培养基 + 5% FBS，通过 10 mL 移液器轻柔吹打 2 次，重悬细胞沉淀。按以下方法进行细胞计数。

4. 细胞铺板的标准计算方法

  1. 采用无菌技术，轻轻摇动细胞悬液并转移 15 μL 将细胞悬液转移至微量离心管中。加入 15 μL 0.4% 台盼蓝。轻轻混匀后上样 10 μL 将细胞悬液加入洁净的血细胞计数板（如 Bright Line Counting Chamber，目录号 #1490：Hausser Scientific）的各个计数室中。 http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm).
  2. 在血细胞计数板上至少计数4个象限。被台盼蓝染成蓝色的细胞为死细胞，不应计入。为获得准确的细胞计数，每个象限内理想的细胞数量应为25–75个。
  3. 计数细胞后，计算4个象限的平均值。将细胞平均数乘以10,000，再乘以稀释倍数（若使用推荐体积，则稀释倍数为2），以确定每毫升的细胞数量。需注意，若总体存活率低于92%，可能存在多种原因。存活率偏低的一个原因可能是在使用FBS中和胰酶之前胰蛋白酶消化时间过长；另一个原因可能是血清（FBS）与胰酶的比例过低，导致细胞持续受到胰蛋白酶消化作用；第三，细胞可能过于汇合，因细胞间接触导致干细胞发生分化，进而在胰蛋白酶消化过程中受损。若严格按照本方法操作，可望获得3次或更多次的细胞倍增，得到的细胞群体数量为 >4,000,000 个细胞，起始数量约为 500,000。

5. 接种另一个扩增培养瓶

  1. 为确定接种一个培养容器所需的总细胞数量，将期望的接种密度（每平方厘米6,600个细胞）乘以容器的表面积。2 或每平方厘米表面积接种 500,000 个细胞）2待接种容器的体积。若需接种多个容器，将每个容器所需的细胞数量乘以容器总数。为确定接种每个容器所需的细胞悬液体积（mL），用接种一个容器所需的细胞数量除以细胞悬液中每毫升的活细胞数。若接种多个容器，将单个容器所需的细胞悬液体积乘以待接种容器总数，计算出所需细胞悬液的总体积。
  2. 将所需体积的细胞在 agsNSC 基础培养基 + 5% FBS 中离心，形成松散沉淀。通常将 500,000 个细胞用 agsNSC 基础培养基 + 5% FBS 悬浮至总体积 25 mL，具体操作如前所述。吸除上清液，将松散沉淀重悬于 10 mL agsNSC 扩增培养基中。此额外离心步骤旨在接种前去除 FBS。向 T-75 培养瓶中加入 10 mL 预热的 agsNSC 扩增培养基。将 10 mL 重悬的细胞悬液加入 T-75 培养瓶，然后加入 40 μL 向培养瓶中加入rh FGF-basic。在决定每次处理的培养瓶最大数量时，应确保胰酶消化和接种过程不超过1.5小时。若使用多个培养瓶，还需准备足量的培养基以进行完全换液。
  3. 轻轻左右摇动锥形瓶以均匀分散细胞，并将培养容器放入 37°C，5% CO₂2 培养箱，如前所述。

6. 用于分化培养板接种的细胞稀释

  1. 可使用任意多孔板格式，但此处描述的是接种至BD Biocoat Poly-L-lysine包被的96孔板。根据实验所需接种的孔数乘以每孔0.2 mL（96孔板）计算细胞悬液所需总体积，并额外增加约10%以补偿接种过程中的体积损失。将细胞稀释至终浓度为75,000个细胞/mL。根据表1确定需加入分化培养基中的FBS量，以达到2% FBS的终浓度。混合FBS与分化培养基。将细胞与计算体积的含FBS分化培养基轻轻混匀。（注意：离心过程中细胞处于agsNSC基础培养基+5% FBS中。FBS在离心过程中可保护细胞并促进细胞贴壁，但会抑制分化。将FBS稀释至2%可允许细胞贴附于多孔板表面，随后进一步稀释FBS以促进分化。分化培养基中还含有胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS-e），以促进细胞分化。）
  2. 在生物安全柜中，使用多通道移液器和大孔径吸头，从无菌排管储液槽中向Poly-L-lysine包被的96孔板每孔加入200 μL稀释后的细胞悬液。将培养板置于37°C、5% CO2条件下孵育1.5–2小时。待细胞贴壁后（约90至120分钟），使用大孔径吸头小心吸出每孔50%的培养基（96孔板为100 μL）。再次使用大孔径吸头，用预温的agsNSC分化培养基小心补充等体积培养基。（使用标准孔径吸头可能损伤细胞。）
  3. 接种后两天（约48小时），使用agsNSC分化培养基和大孔径吸头进行50%的换液操作。

7. 神经元的维持

  1. 根据说明书，使用 NeuraLife、谷氨酰胺和 B27 配制神经元维持培养基。神经元维持培养基应每周配制一次。
  2. 在最后一次 agsNSC 分化培养基更换后的两天（通常为接种后第 4 天），使用神经元维持培养基进行 50% 的换液。
  3. 此后每 2 至 3 天继续使用神经元维持培养基进行 50% 换液。更换为神经元维持培养基后数天内应可见神经元突起。细胞在转移至神经元维持培养基后 3 周内使用为宜。可使用多种市售的神经元标志物对神经元进行鉴定。星形胶质细胞也始终可见。
  4. 培养群体中神经元占总细胞数的比例通常超过 40%。使用除 NeuraLife 外的其他神经元维持培养基可能导致细胞状态不佳，形态上不成熟，且在培养中存活时间较短。

8. 代表性结果：

当以每75 mm培养瓶500,000–600,000个细胞的密度接种时，北极地松鼠成年神经干细胞在至少连续两代培养中，每24小时增殖一倍，可持续3至5天。通过去除碱性成纤维细胞生长因子（basicFGF）和B27，并添加1–2%胎牛血清（FBS）以及1%胰岛素/转铁蛋白/硒（Insulin/Transferrin/Selenium），这些细胞可轻松诱导分化，在14–21天内转变为TUJ1（Covance）阳性神经元（见图2）。神经元占总细胞的比例在40–60%之间，具体比例取决于培养物的培养时间（图3）。接种后第12天至至少第21天期间，神经元可用于实验研究。

细胞培养显微图像；细胞增殖研究；生物学研究；组织生长分析。
图1. AGS成年海马神经干细胞的显微照片。
AGS成年海马神经干细胞在聚-L-鸟氨酸包被的培养瓶中，于agsNSC基础培养基中培养3天后的相差显微图像。细胞约每24小时分裂一次。照片放大倍数为100倍。

荧光显微镜图像；神经元网络可视化；绿色微管，蓝色细胞核染色。
图2. 分化的AGS成人海马神经干细胞的荧光显微图像
AGS神经干细胞在分化培养基中培养4天，随后在Neuralife培养基中继续维持17天，之后进行固定。细胞用4%多聚甲醛固定，并使用TUJ1一抗（Covance）和Invitrogen公司的Alexa Fluor 568二抗（绿色）鉴定神经元。加入Hoechst 33343染料对所有细胞核进行染色（蓝色）。使用Cellomics公司的神经突生长分析软件及Arrayscan仪器测定细胞总数、神经元数量及神经元比例。此图像中神经元比例约为57%。10X放大倍数

神经元生长分析图：随时间变化的平均数量和百分比比率；第16、19、21天
图3. 三种不同培养时间下AGS神经干细胞分化后的神经元数量及神经元比率
AGS神经干细胞经分化培养基诱导分化4天后，分别在Neuralife培养基中继续培养12、15和17天，随后进行固定。细胞固定后，使用TUJ1一抗（Covance）标记神经元，Hoechst染料用于染色所有细胞核以确定总细胞数。通过Cellomics公司的神经突生长分析软件及Arrayscan仪器测定细胞总数、神经元数量及神经元百分比。数据表示每种条件下15个孔的平均值±标准差。

表1. 传代和接种过程中使用的示例计算

  1. 使用浓度为 700,000 个细胞/mL 的细胞悬液
  2. 以每毫升 75,000 个细胞的密度接种，或在每孔 0.2 mL 体积中接种 15,000 个细胞
  3. 向 96 孔中每孔加入 0.2 mL，共 19.2 mL，或根据需要调整至终体积为 21 mL
  4. (终浓度 × 终体积) ÷ 初始浓度 = 初始体积
    (21 mL × 75,000 个细胞/mL) ÷ 700,000 = 2.25 mL
  5. 细胞悬液中含有的 FBS 体积：2.25 mL × 0.05 = 0.1125 mL
  6. 21 mL 培养体系中所需的 FBS 体积 = 21 mL × 0.02 = 0.42 mL
  7. 需添加至分化培养基中的 FBS 体积 = 0.42 mL - 0.1125 mL = 0.3075 mL
  8. 分化培养基的体积 = 21 mL - 2.25 mL 细胞悬液 - 0.3075 mL 5% FBS = 18.44 mL
  9. 将 18.44 mL 分化培养基与 0.308 mL FBS 混合，再加入 2.25 mL 细胞悬液

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讨论

AGS 成人神经干细胞具有很强的增殖能力，可进行多次传代扩增，是研究神经干细胞基本特性的优良细胞来源。其扩增速率约为每 24 小时倍增一次，但必须在细胞达到汇合前进行传代，因为细胞间的接触会促进其向星形胶质细胞分化。如果在胰酶消化和传代前已开始分化，接触介导的分化将导致神经元数量与总细胞数的比例显著下降。图 1 展示了一个应在 24 小时内进行传代的 AGS 神经干细胞培养物。

AGS 神经干细胞可牢固地黏附于聚-L-赖氨酸包被的 Biocoat 培养板，加入 1% 胎牛血清（FBS）90 分钟内细胞不会脱落。当去除 FBS 和重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhFGFbasic）后，细胞将分化为约一半神经元和一半星形胶质细胞。诱导后两周内，神经元将呈现 TUJ1 阳性（图 2），若使用 NeuraLife 培养基，则三周内呈现 MAP2 阳性。成熟神经元受体表达及功能的更全面表征尚在进行中。TUJ1 和 MAP2 的表达是神经前体细胞的特征，这些细胞已决定向神经元命运分化，但仍保留有丝分裂活性10。

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披露

J.A. Kelleher-Andersson 是 Neuronascent 的创始人，也是北极地松鼠专利申请的发明人。Neuronascent 可从 AGS 培养基和干细胞的销售中获得专利使用费。R.C. McGee 任职于 Lifeline, Inc.，该公司负责分销该培养基和 AGS 神经干细胞。

致谢

本研究由美国陆军医学研究与物资司令部资助项目（编号：05178001）以及国立神经疾病与卒中研究所资助项目 NS041069-06 支持。我们感谢 Joel Vonnahme 对本实验方案提出的宝贵意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
agsNSCLifeline Cell TechnologyFC-0004
agsNSC 扩增试剂盒Lifeline Cell TechnologyLL-0008DMEM/F12、B27 和 rhFGFb 的替代来源（www.invitrogen.com）
agsNSC 分化试剂盒Lifeline Cell TechnologyLL-0009DMEM/F12 和 ITS-x 的替代来源（www.invitrogen.com）
NeuraLife 维持培养基试剂盒Lifeline Cell TechnologyLL-0012替代来源包括 NeuraBasal（LifeLine）或 Neurobasal（Invitrogen）、谷氨酰胺和 B27（www.invitrogen.com）。分化后的细胞可在 NeuroLife 中维持培养长达 3 周，但在 Neurobasal 中不超过 2 周（www.invitrogen.com）
显微计数板（如 Bright Line 计数室）Hausser Scientific1490http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm
BD 生物涂层多聚-L-赖氨酸包被的 96 孔板BD Biosciences356516www.bdbiosciences.com
大孔径移液器吸头Fisher Scientific02-707-141可避免移液时对神经元细胞造成损伤。http://www.fishersci.com

参考文献

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