一旦某个基因被鉴定为可能对登革热病毒具有抗性，就必须评估其在蚊子体内预防病毒感染的作用。本实验方案展示了如何检测蚊子中登革热病毒感染的程度。文中演示了病毒在细胞培养中扩增、通过膜饲法使蚊子吸食人血以及检测蚊子中肠内病毒滴度的技术。
本文内容
摘要
摘要
本实验的目的是在实验室条件下使埃及伊蚊感染登革病毒，并检测病毒在蚊虫组织中的感染水平与动态变化。该方案常规用于研究蚊虫与病毒之间的相互作用，尤其适用于鉴定能够决定媒介易感性的新型宿主因子。整个实验必须在生物安全二级（BSL2）实验室中进行。与恶性疟原虫感染实验类似，操作过程中须始终穿戴适当的防护装备，包括手套和实验服。实验结束后，所有接触过病毒的材料均需先用75%乙醇处理并漂白，然后方可进行常规清洗；其余所有材料在丢弃前必须经过高压灭菌处理。
方案
A. 在 C6/36 细胞系中增殖病毒。
- 细胞在75 cm2培养瓶中生长至80%融合度；
- 吸除培养基，保留3–4 ml于培养瓶中；
- 取0.5 ml病毒原液，加入上述细胞中，感染复数为每个细胞1.5个病毒颗粒。在室温下缓慢摇动培养瓶15分钟。
- 在5% CO2、37°C条件下孵育45分钟；
- 加入30 ml培养基，继续孵育5天。
B. 准备病毒与血液的混合物
- 用细胞刮刀刮下细胞，并将细胞及培养基转移至50 mL离心管中；
- 以800g离心10分钟；收集上清液，但保留约1 mL上清液与细胞沉淀一同留存；
- 将上述细胞沉淀 在干冰CO2中冷冻，随后在37°C水浴中解冻，重复两到三次；
- 以800g离心10分钟，取上清液，并与步骤3中收集的上清液合并；
- 采用相同程序（步骤3）采集全人血，用于制备恶性疟原虫配子体培养物，以感染按蚊；
- 将等体积的上述全人血与步骤4所得病毒上清液混合，并加入人血清（终体积的10%）。
- 将上述人血与登革病毒的混合物在37°C水浴中孵育30分钟
C. 喂食蚊虫
该操作步骤与蚊子中Plasmodium falciparum感染部分所述内容几乎完全相同。我们在饲血后第7天检测中肠感染情况，第14天检测唾液腺感染情况。所有接触过病毒的材料均需先用75%乙醇处理，再用10%次氯酸钠溶液处理。
D. 测定蚊虫组织中的病毒滴度
- 在解剖蚊虫组织前两到三天，将 C6/36 细胞接种于 24 孔板中培养，使细胞在实验当天达到 80% 汇合度；
- 将蚊虫置于 4°C 下麻醉，处死后用 75% 乙醇浸泡 1 分钟进行体表消毒。随后用无菌水洗涤两次，在解剖显微镜下解剖中肠或唾液腺。从该步骤开始，后续所有操作均需在无菌环境（如生物安全柜）中进行。将这些组织转移至含有 150 µl 培养基的离心管中，使用 Kontes 微型研磨器电动匀浆 90 秒；
- 取 10 µl 匀浆液加入 990 µl 培养基中，制备 1:100 稀释液；
- 在 96 孔板中用培养基进一步制备 1:10、1:100 和 1:1000 的系列稀释液；
- 吸除 24 孔板中的原有培养基，将上述四种稀释液各取 100 µl 分别加入对应孔中；
- 室温下缓慢振荡 15 分钟，然后在 5% CO2、37°C 条件下孵育 45 分钟；
- 向每孔加入 1 ml 甲基纤维素覆盖层（1%）；
- 将培养板置于 37°C、5% CO2 条件下孵育 5 天；
- 自此步骤起，操作无需无菌环境，但如同处理任何其他病原体，应始终采取适当防护措施。弃去每孔中的甲基纤维素覆盖层，并用吸水纸吸干残留液体；
- 向每孔加入 1 ml 甲醇/丙酮固定液（1:1），4°C 放置 1 小时；
- 倾去固定液，用 1X PBS 洗涤一次；
- 用 5% blotto 将抗病毒的一抗稀释至 1:1000；
- 向每孔加入 200 µl 稀释后的一抗溶液，在 37°C 孵育 1 小时；
- 移除一抗溶液，用 1X PBS 洗涤培养板；
- 在 5% blotto（100 ml 1X PBS 中含 5 g 脱脂奶粉）中按 1:1000 稀释山羊抗小鼠二抗（KPL 货号 074-1806），每孔加入 200 µl，37°C 孵育 1 小时；
- 按以下方法配制底物溶液：将 1 片 3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（Sigma 货号 D5905）溶于 20 ml 1X PBS 中，待完全溶解后加入 8 µl 30% 过氧化氢；
- 向每孔加入 200 µl 上述底物溶液，室温静置 10 分钟；
- 移除底物溶液，并向每孔加入 1 ml 蒸馏水以终止反应；
- 倾去蒸馏水，用吸水纸将孔板吸干；
- 计数病毒斑点（病毒颗粒）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 培养箱 | 含 5% CO2，37°C | |||
| 50 ml 锥形管 | 塑料 | |||
| 移液器吸头 | 用于组织培养 | |||
| 移液器 | ||||
| 巴斯德吸管 | 玻璃，无菌 | |||
| 水浴锅 | 37°C | |||
| 离心机 | ||||
| 封口膜 | ||||
| 循环水浴锅 | ||||
| 玻璃膜饲器 | 配有适合饲器的橡胶管 | |||
| 蚊虫饲养杯 | ||||
| 75% 乙醇 | ||||
| 10% 次氯酸钠溶液 | ||||
| 组织培养板 | 6 孔、24 孔和 96 孔板 | |||
| 培养皿 | 玻璃 | |||
| 载玻片 | ||||
| 细尖镊子 | ||||
| PBS | 1×，无菌 | |||
| 解剖显微镜 | 显微镜 | |||
| C6/36 细胞 | 细胞 | 用于病毒扩增 | ||
| C6/36 培养基 | MEM 加 10% 热灭活 FBS、1% L-谷氨酰胺和非必需氨基酸以及 1% (v/v) 青霉素-链霉素 | |||
| 3’-二氨基联苯胺四盐酸盐 | Sigma-Aldrich | D5905 | 1 片溶于 20 ml 1× PBS 中，溶解后加入 8 μl 30% 过氧化氢 | |
| 30% 过氧化氢 | ||||
| A. aegypti | 动物 | 蚊子 |
重印与许可
