恶性疟原虫蚊虫感染方案及感染表型测定

摘要

一旦某个基因被鉴定为可能具有抗疟疾特性，就必须评估其在蚊子体内抑制疟原虫感染的作用。本方案展示了如何检测疟原虫在蚊子体内的感染程度。文中演示了配子体培养的制备、通过膜饲法使蚊子吸食含人类血液的样本，以及检测蚊子中肠内病毒滴度的技术。

摘要

一旦某个基因被鉴定为可能具有抗疟疾特性，必须进一步评估其在蚊子体内抑制疟原虫感染的作用。本实验方案展示了如何检测疟原虫在蚊子体内的感染程度。文中演示了配子体培养的制备、通过膜饲法使蚊子吸食含疟原虫的人血，以及检测蚊子中肠内疟原虫载量的技术。

方案

A. 配子体培养物的制备：

1. 将新鲜的人类血液和血清在水浴中升温至37^oC。
2. 在通风橱内无菌条件下，用移液器将1 mL温热血液加入离心管中。在离心机中以2200 rpm离心5分钟。红细胞应形成沉淀；移除并弃去上层澄清血清。用等体积的新鲜血清将红细胞洗涤3次，以获得用于配子体的全血。
3. 从CO₂培养箱或蜡烛罐中取出配子体培养物。该培养物应维持在RPMI培养基中，并在培养第16天用于喂食蚊子。为确定培养第16天的配子体血症百分比（%），取一滴血液在玻片上制备薄血涂片，并进行吉姆萨染色。在寄生虫培养物的视野中计数配子体数量，通常范围为2–4%。根据所需最终配子体血症（0.3–1%），计算所需全血的体积。
4. 用移液器吸除配子体培养物中的大部分培养基，注意不要扰动或吸走寄生虫（寄生虫呈黑色，而培养基为浅粉红色/红色）。将剩余的培养基和寄生虫转移至15 mL Falcon管中。在离心机中以2200 rpm离心5分钟。寄生虫和红细胞将形成沉淀，小心移除并弃去上清液，避免扰动沉淀中的寄生虫。
5. 根据前述计算结果，将寄生虫与适量的制备全血（来自步骤A2）混合，以达到所需的最终配子体血症。轻轻吹打混匀约1分钟。

现在，该样品将用于喂养蚊虫。在水浴中保持37^oC。

B. 喂食蚊虫：

1. 将您的 按蚊属 将约30–50只蚊子通过电池供电的吸虫器吸入内衬石蜡的纸板杯中，杯口用橡皮圈或随杯附带的纸板盖固定纱网覆盖。
2. 通过在玻璃进液管两侧插入喷嘴并连接至橡胶管，准备循环水浴装置。根据需要将多个进液管串联连接；串联的一端通过管路连接至水浴循环器的出水口（推动水流通过进液管的部分），另一端则由浸没在水浴中的橡胶管构成，以便循环后的水回流至水浴中。开启水浴装置，使水温升至约37^oC，水通过进水管循环并流回浴槽。这是为了保持血液温度，确保寄生虫存活。
3. 准备膜材料（我们使用拉伸的帕拉菲姆膜小方块），将其拉伸后覆盖在玻璃膜喂食器周围，并施加压力使其与喂食器开口紧密密封。该膜将模拟皮肤。
4. 将一个饲喂器的膜面朝下放置在每个蚊虫饲喂杯上，并使用夹子或胶带固定饲喂器。膜应与网面平齐，以便蚊虫能够从杯内接触到膜。
5. 小心地将步骤 A5 中的寄生虫-血液餐液通过移液器加入饲喂器的颈部，确保血液完全流经颈部进入储液腔，并与膜接触，以便蚊子能够接触到血液。我们通常使用约 200 μ每次饲喂的血量为 l，但此量可有所变化。
6. 让蚊子吸血。我们让它们吸血一段时间 ≈30分钟（可变，取决于实验；对于大多数实验，可通过观察腹部血液含量来偶尔监测已进食个体的数量）。
7. 喂食后，从蚊子饲养杯中移除饲喂器。关闭水浴，并将饲喂器与管路断开。
8. 取出膜后，将喂食器浸泡于10%次氯酸钠溶液中进行去污，随后用水冲洗。将受污染的材料（膜、纸巾、手套等）放入小型生物危害废物袋中，并投入大型生物危害废物容器内。
9. 将装有蚊子的杯子放入冰箱或冷室中使其麻醉。待蚊子完全麻醉后，将其转移至置于冰桶中的培养皿上。仔细检查蚊子的腹部，根据是否有吸血迹象进行分类，并剔除未吸血的个体。部分蚊子腹部会完全充血，另一些则仅呈现狭窄的血带；只要可见摄入血液，均视为“已吸血”。将已吸血的蚊子重新放回纸杯中。
10. 提供糖餐（用10%蔗糖溶液浸湿的棉片），并将蚊虫在正常的昆虫饲养条件下培养7天。每天应监测蚊虫的死亡率。同时，需定期将棉片重新浸湿蔗糖溶液，以确保蚊虫不致饥饿。此外，最好添加一张浸有蒸馏水的纸巾，以保持蚊虫环境湿润。这些蚊虫为 P. falcipraum 已感染，因此必须格外小心，确保没有蚊子从杯中逃出。最好将杯子放入小型笼子中，以提供双重保护。

C. 解剖蚊子中肠并估算卵囊载量：

1. 使用电池供电的吸蚊器从纸杯（步骤 B 中的）吸取蚊子。将吸蚊器可拆卸储液罐内的蚊子移至冷室，或将其埋入冰中至少 5 分钟，直至蚊子停止活动，以实现麻醉。
2. 将麻醉后的蚊子从储液罐转移至置于冰上的玻璃培养皿中，铺成单层，并用塑料培养皿盖覆盖。无法容纳在培养皿中的蚊子保留在储液罐中，并将储液罐放回冷室或冰中。
3. 使用尖头镊子将一只蚊子从培养皿转移至载玻片上的 100 µL PBS 液滴中，载玻片置于解剖显微镜下。其余蚊子保持覆盖状态，留在冷藏的培养皿中。
4. 用尖头镊子夹住蚊子的胸部和腹部后端，将身体拉开，直至中肠暴露。用镊子去除肠道周围的多余组织。肠道呈白色、囊状结构。清除肠道上的多余组织。将肠道置于 12 孔载玻片的一个孔中，并浸入 5–10 µL 的 0.2% 汞溴红溶液中。压碎蚊体残骸并丢弃在湿润的纸巾上。重复操作，直至 12 孔载玻片装满。用玻璃盖玻片覆盖已固定的肠道。
5. 在光学显微镜下检查肠道，寻找呈圆形、在透明或淡粉色肠组织背景下染成亮粉色的卵囊。计数卵囊数量，记录数据，然后继续处理下一个样本。对所有实验处理组的蚊子均重复此操作。
6. 操作完成后，用纸巾擦拭载玻片。将带有肠道的纸巾和带有残骸的纸巾一同放入小型生物危害袋中，并丢弃至垃圾桶。整个操作过程中需佩戴手套，并注意防止任何感染蚊子逃逸。

讨论

疟原虫感染及感染表型的检测可能存在一定差异，不同实验室可能采用不同的技术方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Anopheles	动物			蚊子
Plasmodium falciparum	动物			寄生虫。具有已知配子体血症的配子细胞。
15 mL 锥形管				塑料
血清、血液				人源，O+型
0.2% 汞溴红
载玻片				12 孔
光学显微镜
细胞计数器
10% 漂白剂
移液器吸头				用于组织培养
封口膜
蚊子饲喂装置				玻璃膜饲喂器，适配饲喂器的橡胶管
培养皿				玻璃
细尖镊子
PBS	缓冲液			1X，无菌
循环水浴锅
移液器