哺乳动物中枢神经系统视神经横断后的实验操作方法

摘要

视神经横断是成年中枢神经系统损伤的常用模型。该模型非常适合进行多种实验操作，可全局靶向视网膜，或直接靶向受损的视网膜神经节细胞群体。

摘要

视网膜神经节细胞（RGCs）是中枢神经系统中的神经元，通过视神经将视网膜的视觉信息传递至大脑。视神经可在眼球眶内被暴露并完全横断（轴突切断），从而切断整个RGC群体的轴突。视神经横断是成年中枢神经系统中神经元凋亡性死亡的一种可重复模型^1-4。该模型具有显著优势，因为眼球的玻璃体腔可作为向视网膜递送药物的天然胶囊，允许通过眼内注射进行实验干预。化学物质通过玻璃体液扩散，可作用于全部RGC群体。病毒载体、质粒或小干扰RNA（siRNAs）也可被递送至玻璃体腔，以感染或转染视网膜细胞^5-12。腺相关病毒（AAV）载体对RGC具有高度趋向性，在注射部位附近细胞的感染率接近90%^{6, 7, 13-15}。此外，可通过将siRNA、质粒或病毒载体施加于视神经切断端^16-19，或将载体注射至其靶区上丘¹⁰，实现对RGC的选择性转染。这使得研究人员能够在不干扰其他旁观神经元或邻近胶质细胞的情况下，研究损伤神经元群体中的凋亡机制。RGC的凋亡具有特征性的时间进程：轴突切断后3-4天内细胞死亡被延迟，随后细胞迅速退化。这一时间窗口为针对凋亡相关通路的实验干预提供了机会。直接作用于横断视神经残端的RGC干预操作通常在轴突切断时、即刻切断神经后进行。相比之下，当物质通过眼内途径递送时，可在手术前或术后最初3天内注射，以在轴突切断的RGC启动凋亡之前完成干预。本文中，我们展示了视神经横断后进行实验干预的多种方法。

方案

1. 手术技术

1. 实验应采用无菌技术进行，并遵循您所在机构的动物使用规程。与活体组织接触的器械和材料（溶液、测试物质、示踪剂、针头等）必须保持无菌，以防止感染，避免对动物福利造成不良影响，并防止对研究结果产生潜在的负面影响。

2. 麻醉

1. 使用兽用异氟烷蒸发器系统对大鼠进行麻醉。以0.8 L/min的流速使用医用级氧气汽化异氟烷气体。将动物放入连接的麻醉箱中，并将异氟烷浓度设定为4%，直至动物呼吸减慢并进入镇静状态。
2. 随后，将气体通路切换至立体定位仪的气体面罩装置，并将动物固定于立体定位装置中。将异氟烷浓度下调至2%，并持续监测麻醉状态。体型较大的动物（>300 g）可能需要更高的异氟烷浓度。手术过程中应持续监测麻醉深度，并根据情况调整异氟烷剂量。需持续评估呼吸深度和频率，并每隔5分钟进行足趾夹捏测试，以确认无深部疼痛反应。
3. 手术完成后，关闭异氟烷，让动物在移出立体定位装置前吸入氧气数分钟。手术期间应通过覆盖手术保温毯和/或使用温控加热毯来维持动物体温。

3. 玻璃体内注射用注射器的准备

1. 首先，组装用于进行眼内注射的注射器系统。使用 10 μL RN Gastight 1701 Hamilton 注射器进行注射。移除注射器末端已有的针头或 RN 螺母。
2. 将 PFA 卡环插入 PEEK 杯状卡环的压接接头中，然后将整个接头插入注射器末端，并将 RN 螺母松松地拧在上方。
3. 将 1/16 英寸 PEEK 管的一端插入压接接头，穿过 RN 螺母的开口。确保 PEEK 管完全就位。拧紧 RN 螺母以压紧卡环，从而密封 PEEK 管。
4. 对双 RN 玻璃连接器的两端均执行步骤 3.2。通过拧紧 RN 螺母，将 PEEK 管的自由端连接到双 RN 玻璃连接器的一端。
5. 拉制的玻璃微量移液管将构成注射系统的针头和管体。使用外径为 1.5 mm 的厚壁玻璃毛细管制作玻璃移液管，并将玻璃移液管插入双 RN 玻璃连接器的自由端。拧紧 RN 螺母以固定移液管。
6. 拉制的玻璃微移液管尖端通常过细，不适合进行眼内注射。为了获得合适直径的尖端，需在视觉引导下使用手术显微镜折断玻璃移液管的尖端。载玻片的磨砂端非常适合用于折断移液管。将移液管倾斜持握，并将其尖端在玻璃磨砂面上轻轻摩擦以形成断裂。理想情况下，最终的尖端应略呈斜面。可能需要多次尝试才能获得良好的尖端，因此在使用前应预先拉制多个移液管。
7. 该注射系统为液压驱动，因此在使用前必须用矿物油填充注射器、PEEK 管连接件、双 RN 玻璃连接器以及玻璃微移液管。使用 Hamilton 注射器公司（PRMKIT）的引液套件，将引液注射器充满矿物油。使用大直径针头以便粘稠的油顺利通过。然后更换为 Hamilton 90030 针头，该针头可插入 10 μL Hamilton 注射器的管体中。接下来，在 Hamilton 90030 针头上覆盖一个橡胶隔垫，以便在注入矿物油时提供密封。
8. 将引液注射器的 Hamilton 90030 针头插入注射系统 10 μL Hamilton 注射器管体的后端。将隔垫紧紧压在注射器末端以形成密封。
9. 缓慢推动推杆，你会看到矿物油流经注射系统的玻璃部件，最终充满玻璃移液管。将所有油推过注射系统，以清除管道中的任何气泡。如果填充注射器中的矿物油即将用尽，应在持续注油的同时缓慢拔出针头，以防止形成气泡。必要时重新填充引液注射器并再次注入。
10. 当整个系统完全充满矿物油且无气泡时，插入 10 μL Hamilton 注射器的原始推杆。将推杆压到底端，以从系统中排出多余的矿物油。用 70% 乙醇擦拭清洁玻璃微移液管和注射器末端。
11. 将注射器推杆回抽至管体上的 2 μL 刻度处。玻璃微移液管的尖端将充满空气，从而在矿物油与待注射液体之间形成缓冲区。现在可通过将微移液管末端浸入所需溶液中，并回抽 Hamilton 注射器的推杆来填充移液管。向成年大鼠眼球内注射的溶液体积不得超过 4–5 μL。

4. 眼内注射操作：全局靶向视网膜

1. 将动物麻醉并固定在立体定位仪中（如第2节所述）后，使用Alcaine滴眼液对角膜进行表面麻醉。用手指轻轻分开眼睑，并在角膜表面滴加一滴麻醉液。
2. 注射操作需要两人配合：一人负责将玻璃微量移液管插入玻璃体腔并保持其位置稳定，另一人负责推动注射器活塞，以注入所需溶液。
3. 在手术显微镜下，用手握住玻璃微移液管和Dual RN玻璃耦合器。用另一只手的手指撑开眼睑，在注射部位的对侧形成“V”形。通过牵拉眼睑，使眼球突出于眼眶之外，暴露角膜缘后方的区域。在注射部位对侧以手指形成“V”形，可为眼球提供一个稳定的支撑结构，便于注射时保持稳定。
4. 轻柔地将玻璃微移液管尖端穿过无血管区域的结膜，并以略微向下的角度穿入巩膜。当移液管穿透巩膜时，会感觉到轻微的“弹出”感。以略微向下的角度插入可降低针头触碰晶状体的风险。
5. 持注射器的操作者应推动活塞至注射器上2 μL刻度处，从而注入4 μL溶液。整个注射过程应持续约1至2秒。若注射速度过慢（>3秒），会减少溶液在玻璃体腔内的初始扩散范围。在显微镜下可观察到溶液在玻璃体腔内扩散的过程，从而确认注射成功。
6. 保持微移液管静止约5秒后，沿原插入方向缓慢拔出。结膜将自然回弹覆盖小切口，有助于封闭巩膜穿刺点。
7. 为防止恢复期间角膜干燥，应在角膜表面涂抹眼科眼膏（Tears Naturale P.M.），然后将动物放回恢复笼中。
8. 术后应根据动物护理管理机构的指南给予镇痛药物，并在手术后密切监测动物状态。

5. 从视神经残端选择性靶向视网膜神经节细胞

1. 在视神经横断后，将示踪剂、药物、质粒、siRNA 或病毒载体施加于视神经残端，可通过逆向运输直接靶向视网膜神经节细胞。该操作首先需按照“视神经横断实验方案”²²进行视神经切断手术。
2. 完成该操作主要有两种方法：使用明胶海绵（gelfoam）或直接向视神经内注射。
3. 明胶海绵法类似于逆向示踪技术，但在视神经处递送实验处理物质时，建议在轴突切断前 1 周先向上丘注射逆向示踪剂，以预先标记视网膜神经节细胞。此步骤对细胞示踪至关重要，因为在某些情况下，神经示踪剂可能干扰实验物质的逆向运输，反之亦然。
4. 视神经切断后，立即将一小块浸有实验溶液的明胶海绵置于横断的视神经残端上。随后将眼眶内容物复位。当眼球恢复至中立位置时，需使用镊子将明胶海绵推入眼眶深处，确保其始终覆盖在视神经末端。
5. 对于必须进入轴突胞质才能通过轴浆流进行逆向运输的物质（如 siRNA、质粒，以及某些情况下的病毒载体），注射法更为有效。使用 5–10 μL Hamilton 注射器将所需溶液直接注入横断的视神经中。
6. 用精细尖头 Dumont 镊子夹住视神经边缘。将针头沿神经平行方向插入视神经，直至针尖斜面完全不可见。插入后的针头应被神经组织从四周完全包绕。建议使用短斜面针头。
7. 针头插入神经后，用精细尖头镊子轻轻夹压神经两侧，同时缓慢挤出四分之一剂量的溶液，并将注射器顺时针或逆时针旋转四分之一圈。
8. 重复步骤 5.7，直至完成针头整周旋转，并将注射器内全部溶液注入。为获得最佳效果，建议使用气密性 10 μL Hamilton 注射器，总共注射 10 μL 溶液。
9. 将注射器针头从神经中撤出。保留从神经回流至眼眶内的多余液体，因其可形成额外的液体池，供轴突末端摄取。
10. 将眼眶内容物复位，缝合切口，并让动物恢复。
11. 术后应根据动物护理管理机构的指南给予镇痛处理，并在手术后密切监测动物状态。

6. 代表性结果：

玻璃体内注射可全局性地靶向视网膜中的所有细胞，适用于将物质递送至受损的视网膜神经节细胞（RGCs），因为神经节细胞位于视网膜最内层的神经元层，紧邻玻璃体腔。此外，也可通过向横断的视神经残端递送物质来直接靶向RGCs。如图1所示，可通过神经残端将肽类、药物、载体、质粒或siRNA递送至经Fluorogold逆行标记的RGCs。图1A-C展示了在视顶盖注射Fluorogold预先标记RGCs后，Cy3标记的肽在RGC胞体中的定位情况。在轴突切断后立即向视神经注射Cy3标记的肽，并对活体视网膜进行成像，以防止固定过程中肽从组织中渗出。图1D-F展示了Cy3标记的siRNA与逆行示踪剂Fluogold在轴突切断后的RGCs中的共定位。在轴突切断后立即向视神经残端注射Cy3标记的siRNA，并对活体视网膜进行成像。

图 1. 视神经切断并注射标记肽或siRNA至视神经残端后1天，视网膜平铺标本中视网膜神经节细胞（RGCs）的落射荧光显微图像。(A) 视神经切断术后1天，轴突损伤的RGCs中的Fluorogold逆行标记。(B) 轴突切断及向视神经注射肽后1天，RGCs中因标记肽逆行运输产生的Cy3荧光。(C) (A)与(B)的叠加图像，显示Cy3标记肽在Fluorogold标记RGCs中的选择性定位。(D–F) Fluorogold标记RGCs的胞体(D)也充满了24小时前注射至视神经残端的Cy3标记siRNA(E)，如叠加图像(F)所示。A–C中的比例尺为50 μm。D–F中的比例尺为20 μm。

讨论

视神经横断是成年中枢神经系统神经元凋亡的高度可重复模型。本论文中展示的实验操作可用于研究损伤后视网膜神经节细胞（RGC）凋亡的机制。

眼内注射可用于视网膜的全眼靶向。该操作需要一定练习，关键在于避免玻璃移液管尖端损伤晶状体。研究表明，晶状体损伤可导致生长因子释放，从而改变细胞存活与再生能力^{20, 21}。插入和退出玻璃移液管时，必须小心地使其方向与尖端走向保持平行。若对玻璃移液管尖端施加侧向力，可能导致玻璃碎片进入玻璃体腔，进而损伤晶状体或视网膜。使用尖端过细的移液管可能无法输送黏稠溶液。此外，过于精细的尖端在穿刺巩膜时缺乏触觉反馈，增加了意外穿刺晶状体的风险。在显微镜下观察时，晶状体应保持透明，无任何穿刺痕迹。若晶状体受损，常会形成白内障，导致晶状体混浊，此类实验结果应予以排除。

当管道中没有气泡时，注射器系统的工作效果最佳。空气可能会膨胀和压缩，从而降低溶液抽出或输送的响应性。如果可见气泡，应使用预充注射器和矿物油将其冲洗排出。带有压紧接头的双通道RN玻璃连接器可在不同动物、不同处理之间或发生破损时高效...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
立体定位仪	Stoelting Co.
大鼠气体麻醉面罩	Stoelting Co.
麻醉系统	VetEquip	901806
异氟烷（PrAErrane）	Baxter Internationl Inc.	DIN 02225875
手术显微镜	WPI, Zeiss, Leica
阿莱恩滴眼液	Alcon
人工泪液 P.M.	Alcon
精细尖头杜蒙镊	Fine Science Tools	11252-00
10 μl 汉密尔顿注射器（1701RN；26s/2”/2）	Hamilton Co	80030
1/16 英寸压缩接头	Hamilton Co	55751-01
外径 1/16 英寸，内径 0.010 英寸，PEEK 管路	Supelco, Sigma-Aldrich	Z226661
双通道 RN 玻璃连接器	Hamilton Co	55752-01
矿物油预装套件：包含注射器、针头、橡胶隔垫	Hamilton Co	PRMKIT