视神经横断是成年中枢神经系统损伤的常用模型。该模型非常适合进行多种实验操作，可全局靶向视网膜，或直接靶向受损的视网膜神经节细胞群体。
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摘要
摘要
视网膜神经节细胞（RGCs）是中枢神经系统中的神经元，通过视神经将视网膜的视觉信息传递至大脑。视神经可在眼球眶内被暴露并完全横断（轴突切断），从而切断整个RGC群体的轴突。视神经横断是成年中枢神经系统中神经元凋亡性死亡的一种可重复模型1-4。该模型具有显著优势，因为眼球的玻璃体腔可作为向视网膜递送药物的天然胶囊，允许通过眼内注射进行实验干预。化学物质通过玻璃体液扩散，可作用于全部RGC群体。病毒载体、质粒或小干扰RNA（siRNAs）也可被递送至玻璃体腔，以感染或转染视网膜细胞5-12。腺相关病毒（AAV）载体对RGC具有高度趋向性，在注射部位附近细胞的感染率接近90%6, 7, 13-15。此外，可通过将siRNA、质粒或病毒载体施加于视神经切断端16-19，或将载体注射至其靶区上丘10，实现对RGC的选择性转染。这使得研究人员能够在不干扰其他旁观神经元或邻近胶质细胞的情况下，研究损伤神经元群体中的凋亡机制。RGC的凋亡具有特征性的时间进程：轴突切断后3-4天内细胞死亡被延迟，随后细胞迅速退化。这一时间窗口为针对凋亡相关通路的实验干预提供了机会。直接作用于横断视神经残端的RGC干预操作通常在轴突切断时、即刻切断神经后进行。相比之下，当物质通过眼内途径递送时，可在手术前或术后最初3天内注射，以在轴突切断的RGC启动凋亡之前完成干预。本文中，我们展示了视神经横断后进行实验干预的多种方法。
方案
1. 手术技术
- 实验应采用无菌技术进行，并遵循您所在机构的动物使用规程。与活体组织接触的器械和材料（溶液、测试物质、示踪剂、针头等）必须保持无菌，以防止感染，避免对动物福利造成不良影响，并防止对研究结果产生潜在的负面影响。
2. 麻醉
- 使用兽用异氟烷蒸发器系统对大鼠进行麻醉。以0.8 L/min的流速使用医用级氧气汽化异氟烷气体。将动物放入连接的麻醉箱中，并将异氟烷浓度设定为4%，直至动物呼吸减慢并进入镇静状态。
- 随后，将气体通路切换至立体定位仪的气体面罩装置，并将动物固定于立体定位装置中。将异氟烷浓度下调至2%，并持续监测麻醉状态。体型较大的动物（>300 g）可能需要更高的异氟烷浓度。手术过程中应持续监测麻醉深度，并根据情况调整异氟烷剂量。需持续评估呼吸深度和频率，并每隔5分钟进行足趾夹捏测试，以确认无深部疼痛反应。
- 手术完成后，关闭异氟烷，让动物在移出立体定位装置前吸入氧气数分钟。手术期间应通过覆盖手术保温毯和/或使用温控加热毯来维持动物体温。
3. 玻璃体内注射用注射器的准备
- 首先，组装用于进行眼内注射的注射器系统。使用 10 μL RN Gastight 1701 Hamilton 注射器进行注射。移除注射器末端已有的针头或 RN 螺母。
- 将 PFA 卡环插入 PE....
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讨论
视神经横断是成年中枢神经系统神经元凋亡的高度可重复模型。本论文中展示的实验操作可用于研究损伤后视网膜神经节细胞（RGC）凋亡的机制。
眼内注射可用于视网膜的全眼靶向。该操作需要一定练习，关键在于避免玻璃移液管尖端损伤晶状体。研究表明，晶状体损伤可导致生长因子释放，从而改变细胞存活与再生能力20, 21。插入和退出玻璃移液管时，必须小心地使其方向与尖端走向保持平行。若对玻璃移液管尖端施加侧向力，可能导致玻璃碎片进入玻璃体腔，进而损伤晶状体或视网膜。使用尖端过细的移液管可能无法输送黏稠溶液。此外，过于精细的尖端在穿刺巩膜时缺乏触觉反馈，增加了意外穿刺晶状体的风险。在显微镜下观察时，晶状体应保持透明，无任何穿刺痕迹。若晶状体受损，常会形成白内障，导致晶状体混浊，此类实验结果应予以排除。
当管道中没有气泡时，注射器系统的工作效果最佳。空气可能会膨胀和压缩，从而降低溶液抽出或输送的响应性。如果可见气泡，应使用预充注射器和矿物油将其冲洗排出。带有压紧接头的双通道RN玻璃连接器可在不同动物、不同处理之间或发生破损时高效.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
PDK 受加拿大卫生研究院运营资助（MOP 86523）支持
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 立体定位仪 | Stoelting Co. | ||
| 大鼠气体麻醉面罩 | Stoelting Co. | ||
| 麻醉系统 | VetEquip | 901806 | |
| 异氟烷（PrAErrane） | Baxter Internationl Inc. | DIN 02225875 | |
| 手术显微镜 | WPI, Zeiss, Leica | ||
| 阿莱恩滴眼液 | Alcon | ||
| 人工泪液 P.M. | Alcon | ||
| 精细尖头杜蒙镊 | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| 10 μl 汉密尔顿注射器（1701RN；26s/2”/2） | Hamilton Co | 80030 | |
| 1/16 英寸压缩接头 | Hamilton Co | 55751-01 | |
| 外径 1/16 英寸，内径 0.010 英寸，PEEK 管路 | Supelco, Sigma-Aldrich | Z226661 | |
| 双通道 RN 玻璃连接器 | Hamilton Co | 55752-01 | |
| 矿物油预装套件：包含注射器、针头、橡胶隔垫 | Hamilton Co | PRMKIT |
参考文献
- Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).
- Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. Molecular deter....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS
Posted by JoVE Editors on 5/31/2011. Citeable Link.
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