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一种研究足底电击诱发大鼠可卡因觅药行为复燃的实验方法

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DOI：

10.3791/2265

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2011年1月6日

 ,  , 
1Psychology, University of Toronto Scarborough

本文内容

摘要

已广泛使用被称为复吸恢复程序的动物模型来研究应激在药物复吸中的作用。本文报道了一种通过短暂间歇性足底电刺激诱导实验大鼠可卡因觅药行为恢复的方法。

摘要

药物成瘾最隐匿的特征是极高的复吸倾向。用于研究复吸的动物模型，即复燃实验程序，已被广泛用于探索药物复吸的神经生物学机制和现象学特征。尽管在过去几十年中出现了多种实验流程的变体，但最传统的复燃程序均基于药物自我给药（SA）模型。在此模型中，动物被训练执行一种操作性反应以获得药物。随后，通过停止给予与反应相关的强化物来消除该行为。药物寻求行为的复燃则可通过某些特定事件触发，例如注射训练用药物、重新暴露于与药物相关的线索，或暴露于应激刺激1。

恢复程序最初被开发用于研究急性非条件性接触训练药物后，能否在大鼠和猴子中恢复觅药行为1, 2。此后，恢复程序已被改进，用于研究环境刺激（包括与药物相关的线索以及各种应激因素的暴露）在觅药复吸中的作用1, 3, 4。

在过去的15年中，复吸研究领域的一个主要焦点是应激在药物复吸中的作用。用于研究这种关系的最常见应激形式之一是短暂暴露于轻度、间歇性的足底电击。Shaham及其同事（1995年）首次在具有静脉内海洛因自身给药史的大鼠中证明了足底电击应激可诱发药物寻求行为的复燃5。随后，这一效应被推广至具有静脉内可卡因、甲基苯丙胺和尼古丁自身给药史，以及口服乙醇自身给药史的大鼠3, 6。

尽管足底电击诱发的觅药行为复燃能够可靠且显著地实现，但该效应往往对某些参数变量较为敏感。这些变量包括消退阶段和复燃测试阶段的安排、足底电击应激的强度和持续时间，以及在消退和复燃测试期间是否存在与药物相关的线索。本文介绍了一种我们长期成功使用的、用于研究应激与可卡因觅药行为之间关系的足底电击诱发可卡因觅药复燃的实验方案。

方案

1. 动物饲养与适应性驯化程序

  1. 雄性 Long Evans 大鼠在进入动物房时体重为 300–325 g，单只饲养于标准塑料笼中，笼内铺有再生纸粒垫料，并配有带金属网盖的笼盖以放置饮水瓶和饲料。
  2. 大鼠饲养在温度与湿度受控的动物房内，采用倒置的明暗循环光照程序（光照时间：19:00 至 07:00）。
  3. 在整个实验期间，大鼠在饲养笼内可自由获取食物和饮水。
  4. 在手术前，大鼠需在动物房环境中适应一周。在此期间，除常规清洁、喂食及体重监测外，不进行其他干扰。

2. 静脉注射导管手术

  1. 在异氟烷气体麻醉下，采用标准无菌外科技术，将硅胶导管插入大鼠右侧颈静脉。导管经颅骨表面的改良套管（Plastics One）引出，并使用珠宝商螺丝和牙科水泥将套管固定于颅骨上。有关手术操作的详细信息，请参见7, 8。
  2. 手术结束时，用约 0.2 mL 含 50% 肝素（1000 IU）和 50% 葡萄糖（25 g/50 mL）的溶液冲洗导管。在套管开口处放置一个塑料堵头，以防止外部碎屑污染并维持导管通畅。
  3. 在手术当日以及术后次日，皮下注射 5 mg/kg 的镇痛药酮洛芬。
  4. 手术后，大鼠至少恢复七天方可开始实验。在此期间，除常规清洁、喂养及每日体重与整体健康状况监测外，大鼠在饲养笼内保持不受干扰。恢复期最后一天，使用肝素/葡萄糖溶液（第 2.2 节）冲洗导管，以确认导管通畅性。

3. 行为学实验步骤

所有行为学实验均使用由 Med Associates Inc.（St Albans, VT）提供的设备进行。这些设备位于专用房间内，包括一组标准操作式条件反射箱，每个箱子均置于隔音箱中。每个操作式条件反射箱内设有两个可伸缩的杠杆，均位于不锈钢栅栏地板上方 6.5 cm 处。其中一个杠杆上方设有一个白色刺激灯，对该杠杆（即所谓的“活动”杠杆）的反应会同时触发刺激灯的点亮和输注泵的启动（Razel Scientific Instruments, St. Albans, VT）。输注泵放置在操作箱外侧的一个架子上，但仍处于隔音箱内部。另一个杠杆（即所谓的“非活动”杠杆）在整个实验过程中始终保持伸出状态；对该杠杆的反应不会产生任何后果。最后，每个实验箱均配备可通过扰频器向钢栅地板传递恒定电流、间歇性、不可逃避的足底电击的装置。所有实验条件（例如，刺激呈现、药物输注、电击传递）以及数据记录与整合均通过实验箱与运行 Med Associates 软件（MED-IV）的中央计算机之间的接口实现。

实验分为5个阶段进行：1）适应期；2）可卡因自身给药（Cocaine SA）；3）无药物期；4）消退期；以及5）复吸测试。除无药物期外，在所有阶段中，大鼠均从饲养室每日转移至操作式条件反射实验箱中进行实验。大鼠以个体为单位，使用小型塑料容器单独转移。在操作式条件反射实验箱内不提供食物和水。

  1. 适应期
    1. 在首次可卡因自身给药（SA）实验前24小时（参见第3.2节），允许大鼠在操作箱内进行一次持续2小时的适应性训练；在此期间，主动杠杆处于收回状态。
  2. 可卡因SA训练
    1. 每次每日训练开始前，先在饲养室称量大鼠体重，随后将其转移至操作箱中。
    2. 将大鼠放入操作箱后，将连接于药物输注泵的弹簧-导管组件连接至颅骨固定套管。
    3. 允许大鼠在每日3小时的训练中自行注射盐酸可卡因，共进行8–10天（可连续进行，或在第5与第6次训练之间插入两个“休息日”）。
    4. 训练会交替安排在上午（9:00–12:00）和下午（13:00–16:00）进行。训练时间交替安排的原因是，实验后续阶段（即消退与测试阶段）的程序对所有动物均在两个时间段进行（参见第3.4与3.5节）；因此，这种安排可避免因一天中不同时段对后续觅药行为造成混杂效应。
    5. 每次训练前均设置5分钟的适应期，在此期间将动物放入操作箱，主动杠杆保持收回状态。
    6. 训练开始时，主动杠杆被推出箱内，同时点亮位于主动杠杆上方的刺激灯，持续30秒。此外，此时也开启箱内主灯，并在整个训练期间保持点亮。上述事件共同提示可卡因的可获得性。
    7. 在训练期间，主动杠杆上的反应通过固定比率1（FR-1）强化程序获得一次持续3秒的可卡因输注（0.23 mg/65 μL，静脉注射）。在启动输注泵并给药的同时，主动杠杆上方的刺激灯持续点亮20秒。该20秒的灯光持续期对应一个“暂停”期，在此期间额外的主动杠杆反应会被记录但不被强化。
    8. 每3小时训练最多允许50次输注。我们在实验中常规采用此标准，经验表明该限制可显著减少甚至消除因过量导致的死亡事件。
    9. 每次每日训练结束后，用0.2–0.3 mL肝素-葡萄糖溶液冲洗大鼠导管（参见第2.2节），然后将大鼠送回饲养笼。
  3. 无药物期
    1. 最后一次可卡因SA训练结束后，大鼠在饲养笼中静置至少7天（除常规清洁、喂食及体重监测外不进行任何干扰）。
  4. 可卡因训练行为的消退
    1. 在09:00–10:00之间将大鼠转移至操作箱进行消退训练。
    2. 将弹簧-导管组件连接至颅骨固定套管。
    3. 与SA训练条件一致，每天的消退训练前均设置5分钟适应期，期间将动物放入操作箱，主动杠杆保持收回状态。
    4. 随后给予大鼠四次60分钟的消退训练，每次之间间隔30分钟。每次60分钟的消退训练均以与训练开始时相同的事件启动（即主灯点亮、主动杠杆推出、主动杠杆上方刺激灯点亮30秒）。在整个训练期间，维持SA训练中的所有条件（即反应依赖的刺激灯点亮20秒、输注泵激活3秒），但主动杠杆反应不再伴随可卡因输注。在每次60分钟消退训练之间的30分钟间隔期内，主动杠杆被收回，主灯熄灭。
    5. 最后一次60分钟训练结束后，将大鼠送回饲养笼。
    6. 重复执行步骤3.4.1至3.4.5，连续进行3天。
  5. 通过足底电击应激诱导可卡因训练行为的复现
    1. 在09:00–10:00之间将大鼠转移至操作箱。
    2. 将大鼠放入操作箱后，将弹簧-导管组件连接至颅骨固定套管。
    3. 与训练和消退阶段一致，设置5分钟适应期，期间将大鼠放入操作箱，主动杠杆保持收回状态。
    4. 随后给予大鼠两次60分钟的消退训练（参见3.4.4），两次之间间隔30分钟，训练条件与消退阶段完全相同。
    5. 若第二次60分钟训练结束后，此前主动杠杆上的总反应次数少于15次，则在额外30分钟间隔后进行复现测试。在此30分钟间隔期内施加足底电击或假电击（即无电击）（参见3.5.6）。若第二次训练后主动杠杆反应未达到15次或更少的标准，则在进行复现测试前追加一次或多次消退训练。
    6. 第二次60分钟消退训练结束后10分钟（或在追加任何必要的60分钟消退训练以达到≤15次反应的消退标准后），在操作箱内对动物施加20分钟间断性足底电击应激（或假电击）。电击期间主动杠杆处于收回状态，主灯和刺激灯均熄灭。电击按可变时间表给予，平均间隔40秒（范围10–70秒），每次电击强度为0.9 mA，持续时间为0.5秒。这些电击参数基于本实验室大量预实验确定，旨在以最低强度和持续时间可靠诱导可卡因觅药行为的复现。在此参数下，动物对0.5秒电击表现出反射性跳跃反应，偶尔发出短暂叫声。尽管在电击期间持续观察动物，但电击强度不足以引发更明显的痛苦表现。
    7. 足底电击结束后立即推出主动杠杆，允许大鼠在消退条件下进行杠杆按压（即反应不伴随可卡因强化，但仍会触发刺激灯点亮和输注泵激活）。该阶段定义为复现测试期，通常持续1–3小时。大部分反应发生在测试初期（前30分钟至1小时），随后在更长测试期内逐渐消退。因此，1小时测试已足以捕捉复现效应，而更长测试期可更完整地描绘该效应的消退过程。
    8. 若采用重复测量设计，则每只大鼠需分别接受足底电击与假电击条件的测试。在后续测试日重复执行步骤3.5.1至3.5.8，并施加另一种复现测试条件（足底电击或假电击）。

4. 代表性结果：

自我给药、消退、复吸实验图示；行为分析；药物反应实验。
图 1. 自我给药训练、消退及复吸测试期间，动物在主动杠杆与非主动杠杆上的活动行为模式示意图。

图1展示了程式化操作性反应曲线，这类曲线是本实验方案所述各个阶段中通常获得的典型结果。

1. 主动杠杆反应

  1. 可卡因自身给药训练。 图1（左图）显示了一条典型的可卡因自身给药训练曲线，包括输注次数和主动杠杆按压总次数。大鼠通常在1–3次训练中即可学会可卡因自身给药行为，一旦该行为建立，在后续训练中会维持稳定的药物摄入率（通常会话间差异小于20%）。
  2. 可卡因训练行为的消退。 从图1（中图）可见，在消退第1天，当主动杠杆按压首次不再获得强化时，主动杠杆的反应总数最初高于训练阶段末期（即所谓的“消退爆发”）；在随后的四次消退训练中，反应次数逐渐减少。在消退第2天和第3天，可能会观察到反应次数的部分恢复（相对于前一天最后一次训练时的水平）；然而，反应次数通常仍少于前一天消退开始时的水平，且当天的消退过程通常在四次训练中进展更快。
  3. 可卡因觅药行为的复燃。 从图1（右图）可见，暴露于间歇性足底电击20分钟后，主动杠杆的非强化反应次数较前一次消退训练结束时有所增加。与假电击处理条件相比，足底电击也会引起反应次数的增加。因此，由足底电击应激诱导的可卡因觅药复燃可表现为以下两种形式之一：1）与电击前的消退训练相比，电击后非强化反应次数增加；或 2）与假电击条件相比，电击后非强化反应次数增加。

2. 无活动杠杆反应

如图1（红线）所示，在所有实验阶段，与非活动杠杆相关的反应水平都非常低。然而，有时在遭受足底电击应激后，该杠杆上的反应会出现轻微增加。即使在出现此类反应增加的情况下，活动杠杆上的反应增加通常也相对大得多。

讨论

在过去的几十年中，为了研究实验大鼠和猴子中觅药行为的复燃，已开发出三种不同的自身给药（SA）复燃实验程序。这些程序变体的主要区别在于药物自身给药（drug SA）、消退训练以及测试阶段是在同一天内完成还是在不同天进行1。本文所描述的程序通常被称为“日内-日间混合型”变体，因为药物自身给药在每日的独立训练阶段中进行（即以日间方式发生），与消退和测试阶段分开；而消退和测试则在同一天内完成（即以日内方式发生）[例如，7, 9]。另一种称为“完全日间型”程序中，实验的所有阶段依次进行，即自身给药、消退和测试分别在不同的日子进行（即所有阶段均为日间安排）[例如，8, 10, 11]。相比之下，在完全“日内型”程序中，自身给药训练、消退和测试均在同一天内完成[例如，12]。

尽管已有文献报道采用不同形式的复燃实验程序来诱导足底电击引发的觅药行为复燃，但我们发现，对于具有可卡因自身给药史的动物而言，当消退训练和测试在同一天内进行（即采用“会话内-会话间”模式）时，该应激源的效果最为显著。此外，我们亦成功采用完全“会话间”模式实现了稳定可靠的足底电击诱导的可卡因觅药复燃，但仅在动物在整个实验期间持续饲养于自身给药装置内8，或至少在消退和测试阶段保持在此环境中时才有效13。与本实验方案所述方法相比，这种会话间方法的缺点在于限制了可同时训练和测试的动物数量，从而降低了数据采集的效率。尽管根据本方案的条件，同一时间仅能对一组动物进行消退和测试，但通过将两组大鼠的自身给药训练阶段起始时间错开一周，可显著提高实验通量。在此安排下，当第二组大鼠进入自身给药训练的第二周时，第一组大鼠即可进入无药物阶段；随后，在第二组处于无药物阶段时，可对第一组大鼠实施消退和测试。该策略能够更高效地利用实验资源，加快数据获取速度，同时仍可获得高度有效且可重复的足底电击诱导觅药复燃效应。

重要的是，在我们的实验流程中，先前由药物强化的行为的消退以及复燃测试均在药物相关线索存在的情况下进行。尽管我们从未在缺乏药物相关线索的条件下开展过消退训练或测试，但根据我们与同行的交流得知，当测试在已消退线索缺失的情况下进行时，应激源实际上可能无法有效诱导复燃行为（至少对于有可卡因自身给药史的动物而言是如此）。对该变量进行系统性考察及其所涉及的理论意义，是未来研究的重要问题。

最后一个需要说明的程序性因素是，足底电击应激对复吸的影响似乎对环境背景的改变极为敏感。例如，只有在药物自身给药（SA）和消退训练所发生的环境中施加足底电击应激，才能有效诱导药物寻求行为的复吸；也就是说，如果应激暴露发生在一个新的环境中，则足底电击无法引发药物寻求行为的复吸，这表明应激源与药物相关环境在影响复吸过程中存在重要的相互作用14。

总之，足底电击复燃实验程序（如本文所述）已被成功用于阐明应激与药物复吸之间关系的基本行为学和神经生物学机制。事实上，当这些程序经过改进，以适应针对特定神经元底物的药理学预处理或神经化学操控时，可成为研究应激诱发药物觅求复燃神经生物学机制的有力工具。

披露

动物实验严格遵循加拿大动物护理委员会和多伦多大学动物护理委员会制定的指南与规定进行。 本视频的制作由Med Associates, Inc.公司赞助，该公司生产了本文所使用仪器。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
大鼠基础药物自我给药测试套装figure-materials-1 Med Associates, Inc.MED-008-CT-B1
深型加高MDF隔音箱大鼠基础药物自我给药测试套装组件figure-materials-2 Med Associates, Inc.ENV-018MD
带药物输注顶盖和废液盘的标准模块化测试舱大鼠基础药物自我给药测试套装组件figure-materials-3 Med Associates, Inc.ENV-008CT
不锈钢网格地板大鼠基础药物自我给药测试套装组件figure-materials-4 Med Associates, Inc.ENV-005
带遮光罩的舱内照明灯，28V大鼠基础药物自我给药测试套装组件figure-materials-5 Med Associates, Inc.ENV-215M
刺激光源，1” 白色透镜大鼠基础药物自我给药测试套装组件figure-materials-6 Med Associates, Inc.ENV-221M
低剖面可伸缩反应杠杆大鼠基础药物自我给药测试套装组件figure-materials-7 Med Associates, Inc.ENV-112CM
SmartCtrl 8输入/16输出控制模块大鼠基础药物自我给药测试套装组件figure-materials-8 Med Associates, Inc.DIG-716P2
单速注射泵，3.33 RPM大鼠基础药物自我给药测试套装组件figure-materials-9 Med Associates, Inc.PHM-100
大鼠自我输注套装大鼠基础药物自我给药测试套装组件figure-materials-10 Med Associates, Inc.PHM-119B-23-D
药物递送臂组件大鼠基础药物自我给药测试套装组件figure-materials-11 Med Associates, Inc.PHM-110-SAI
方波厌恶刺激发生器足底电击应激组件figure-materials-12 Med Associates, Inc.ENV-414S
专利快速断开式不锈钢网格地板连接装置足底电击应激组件figure-materials-13 Med Associates, Inc.ENV-005-QD
电击输出电缆足底电击应激组件figure-materials-14 Med Associates, Inc.SG-219G-10
MED-PC IV 软件软件figure-materials-15 Med Associates, Inc.SOF-735

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