基因组印记是植物和哺乳动物繁殖过程中的一种现象。DNA甲基化在印记机制中起着重要作用。在拟南芥（Arabidopsis）中分离胚乳并确定印记基因的甲基化状态可能较为困难。本实验方案中，我们描述了如何分离胚乳，并通过亚硫酸氢盐测序法测定甲基化状态。
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摘要
摘要
拟南芥 是一种研究表观遗传机制的优良模式生物。其中一个原因是其DNA甲基转移酶的功能缺失型空突变体具有 viability（存活能力），从而提供了一个研究基因组中DNA甲基化缺失如何影响生长和发育的系统。基因组印记（imprinting）是指母源和父源等位基因的差异表达，在哺乳动物和植物的生殖发育过程中发挥重要作用。DNA甲基化对于决定印记基因的母源或父源等位基因是否表达或沉默至关重要。在开花植物中，繁殖过程存在双受精事件：一个精子细胞与卵细胞融合形成胚胎，另一个精子则与中央细胞融合发育为胚乳。胚乳是植物中发生基因组印记的组织。 MEDEA，一个含有SET结构域的多梳群基因，以及 FWA，一种调控开花的转录因子，是首批被证实于胚乳中具有基因组印记现象的两个基因，其表达受植物中DNA甲基化与去甲基化的调控。为了确定某个基因在胚乳中的印记状态以及甲基化模式，我们首先需要能够分离出胚乳。由于种子非常微小，在 拟南芥，分离仍然具有挑战性 拟南芥 胚乳并检测其甲基化状态。在本视频方案中，我们介绍了如何进行遗传杂交、从种子中分离胚乳组织，以及通过亚硫酸氢盐测序确定甲基化状态。
方案
一、遗传杂交
1. 去除母本的雄蕊
为了利用DNA序列多态性区分母本和父本等位基因，需选择两种不同的生态型（例如 Columbia-0 (Col-0) 和 Ler）分别作为雌性亲本和雄性亲本。植株应保持幼嫩且健康。可通过解剖显微镜、放大头戴镜或肉眼对雌性亲本进行去雄操作。找到第12阶段的花（Smyth et al., 1990），用剪刀剪除其上方和下方的所有花或角果的花梗基部。将镊子尖端基部轻轻浸入盛有95%乙醇的烧杯中进行消毒，以去除镊子上可能附着的花粉粒并杀死花粉。用镊子轻轻拨开花蕾，小心去除4片萼片、4片花瓣和6枚雄蕊，仅保留裸露且完整的雌蕊。此过程中应尽量避免对子房造成损伤。
2. 选择花粉供体并进行授粉
最佳的花粉供体是处于第14阶段、花瓣与雌蕊呈90°角展开的开放花朵（Smyth et al., 1990），此时有大量花粉正在散出。用手握住花朵基部及花梗上方，即可使花朵展开。用花药轻擦已准备好的柱头。授粉后，柱头将被黄色花粉覆盖，在显微镜下可轻易观察到。
3. 标记杂交
对一株植物上所有去雄的雌蕊完成授粉后，我们使用珠宝标签标记杂交组合，并注明母本、父本信息及授粉日期。在植株附近的土壤中插入一根支柱，用绳子将花序的茎秆绑在支柱上，并用塑料袋罩住已授粉的雌蕊。
II. 胚乳组织的分离 拟南芥
1. 准备材料
在分离胚乳和胚组织之前，我们通常会准备好以下必要材料：液氮罐、液氮、解剖显微镜、两把新的尖头镊子（5 INOX. FST，Dumont biology，瑞士）、载玻片（3" × 1" × 1.0 mm）以及pH 5.7的0.3 M山梨醇与5 mM MES溶液。
2. 收集角果
授粉后第7至8天（DAP），种子已发育至胚胎发生中期至晚期鱼雷形阶段，可进行收获，并分离胚乳和胚胎。有时若去雄的花朵过于幼嫩，可能需要等到授粉后第9至10天。
3. 分离胚乳和胚
由于拟南芥（Arabidopsis）种子非常微小，我们使用解剖显微镜来分离胚乳和胚。将一个8天龄的角果置于显微镜下，用一对镊子夹住角果的果柄，再用另一对镊子的尖端在两个心皮融合的边缘处将角果轻轻拨开。用镊子夹取一颗种子放入含0.3 M山梨醇和5 mM MES、pH 5.7的溶液中，在种子的珠孔端做一小切口，滑出胚；挤压未切割的一端，使胚乳挤出，并将胚乳与种皮分离（Kinoshita et al., 2004）。将分离出的胚和胚乳分别放入装有液氮的微量离心管中。重复此操作，直至收集到来自10–15个角果的胚或胚乳，随后将样品管储存于–80°C冰箱中。在某些情况下，胚乳无需与种皮完全分离，例如在进行基因印记分析时，可直接从胚乳与种皮的混合物中提取总RNA。
III. 亚硫酸氢盐测序
1. 所需试剂
用于制备基因组DNA的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、限制性内切酶、新鲜配制的3 M NaOH、6.42 M尿素/4 M亚硫酸氢钠（2 M偏亚硫酸钠，Sigma-Aldrich，货号 S9000，Na2S2O5，分子量：190）、10 mM对苯二酚、DNA纯化试剂盒（Promega Wizard DNA Clean-up System，货号 A7280）、TE缓冲液、新鲜配制的6.3 M NaOH、10 M NH4OAc、20 μg/μL tRNA以及100%乙醇。
2. 亚硫酸氢盐处理方案的详细步骤
- 使用 CTAB 法（Rogers 和 Bendich，1988）分离基因组胚乳或胚胎 DNA。
- 用能够切割待分析区域之外序列的限制性内切酶，在 20 μL 至 100 μL 总体积中消化 100 ng - 2 μg 基因组 DNA。对于 MEA 启动子，我们使用 XhoI、NdeI 和 PstI 或 HindIII。
- 将 DNA 沸水浴 5 分钟以使限制性内切酶失活，然后立即置于冰上淬灭。
- 加入 1/9 体积（对于 20 μL 消化的 DNA 为 2.2 μL）的 3 M NaOH，并在 37 °C 下孵育 15 分钟。
- 将溶液转移至 250 μL 的 PCR 管中。
- 将 7.5 g 尿素溶解于 10 mL 无菌蒸馏水中；在 1-2 小时内缓慢加入 7.6 g 偏重亚硫酸钠，加热通常有助于溶解；用新配制的 10 M NaOH 将 pH 调至 5；加入无菌蒸馏水至终体积为 20 mL。此即为 6.24 M 尿素/4 M 偏重亚硫酸钠溶液。
- 将 6.24 M 尿素/4 M 偏重亚硫酸钠溶液加入 DNA 中，使其终浓度分别为 5.36 M 和 3.44 M（Paulin et al., 1998）。例如，向上述 22.2 μL 变性基因组 DNA 中加入 208 μL 的 6.42 M 尿素/4 M 偏重亚硫酸钠溶液（Xiao et al., 2003）。
- 向 DNA 中加入 10 mM 对苯二酚，使其终浓度为 0.5 mM（对于 20 μL 消化体系加入 12 μL）。
- 在 PCR 仪中进行亚硫酸氢盐处理：进行 30 个循环，每循环 55 °C 孵育 15 分钟，95 °C 孵育 30 秒。
- 使用 Promega 的 Wizard DNA Clean-Up System 对亚硫酸氢盐处理后的 DNA 进行脱盐，并按照说明书操作（Jacobsen et al., 2000）。
- 准确测量脱盐后从柱子洗脱出的 TE 体积，并加入 6.3 M NaOH 至终浓度为 0.3 M。在 37 °C 下孵育 15 分钟。
- 加入 10 M NH4OAc（pH 7.0）至终浓度为 3 M，加入 2 μL 的 20 μg/μL tRNA，以及 3 倍体积的 100% 乙醇，混匀。在 14,000 rpm 下离心 15 分钟。
- 用 70% 乙醇洗涤沉淀一次，短暂离心后去除多余的乙醇。
- 在真空浓缩仪中干燥沉淀 5-10 分钟，根据起始 DNA 量用 25 - 100 μL TE 缓冲液重悬。此时，亚硫酸氢盐处理后的 DNA 即可用于 PCR 分析。
3. PCR 扩增
- 由于未甲基化的胞嘧啶会转化为尿嘧啶，因此使用经亚硫酸氢盐处理的 DNA 作为模板扩增大片段片段较为困难。因此，我们通常设计引物以扩增不超过 500 bp 的产物。为了测序 4 kb 的 MEA 启动子区域，我们设计了多对引物，扩增出 14 个相互重叠的片段以覆盖整个区域（Xiao et al., 2003）。
- 为了测序正链，在设计正向引物时：I）选择富含 G（鸟嘌呤）的区域，以便在引物中无需额外延长核苷酸即可获得较高的退火温度；II）在 CG 和 CNG 背景下将 C（胞嘧啶）替换为 Y（嘧啶），并将其余的 C 替换为 T（胸腺嘧啶）。在设计反向引物时：I）选择富含 C 的区域；II）在 CG 和 CNG 背景下将 G 替换为 R（嘌呤），并将其余的 G 替换为 A（腺嘌呤）。
- 为了测序负链，在设计正向引物时：I）选择富含 C 的区域；II）在 CG 和 CNG 背景下将 G 替换为 R（嘌呤），并将其余的 G 替换为 A（腺嘌呤）。在设计反向引物时：I）选择富含 G 的区域；II）在 CG 和 CNG 背景下将 C 替换为 Y（嘧啶），并将其余的 C 替换为 T（胸腺嘧啶）。
- 我们通常每次 PCR 扩增使用 1–2 μL 亚硫酸氢盐处理的 DNA 作为模板（Xiao et al., 2003）。PCR 产物需通过琼脂糖凝胶电泳分析以确认片段大小正确，然后进行胶回收纯化，并克隆至 TOPO TA 克隆载体 pCR2.1（Invitrogen）中作为插入片段。挑取单个菌落进行培养，提取质粒 DNA 并送测序。
4. 序列分析
亚硫酸氢盐测序的原理是，在pH 5.0条件下，高浓度的亚硫酸氢钠可导致未甲基化的胞嘧啶发生水解性脱氨反应，转化为尿嘧啶，随后在PCR扩增产物中被扩增为胸腺嘧啶；而5-甲基胞嘧啶则不会被亚硫酸氢钠修饰，在PCR扩增后仍保持为胞嘧啶（Clark et al., 1994；Frommer et al., 1992）。获得测序结果后，我们将其与用于PCR扩增的链特异性模板进行比对。如果模板中的某个胞嘧啶残基在测序结果中显示为胸腺嘧啶，则表明该胞嘧啶未发生甲基化；如果模板中的胞嘧啶残基在测序结果中仍为胞嘧啶，则说明该胞嘧啶发生了甲基化。
四、代表性结果
图 1.
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讨论
将胚胎与胚乳和种皮分离相对容易，但将胚乳与种皮分开则较为繁琐，尤其是处于胚胎发生早期或中期鱼雷形阶段的种子。由于种皮所贡献的组织量极小，对于某些基因（例如 MEA 和 FWA），我们无需将胚乳与种皮分离。这意味着我们可以从胚乳和种皮组织的混合物中提取RNA，检测某个基因的母源和父源等位基因的表达情况，与胚胎中的表达进行比较，从而确定该基因的基因组印记状态。
对于亚硫酸氢盐测序，设计的引物需要具有链特异性。由于亚硫酸氢钠处理会损伤DNA模板，有时难以从经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA中扩增出目标片段，因此我们通常尝试在不同区域设计多组PCR引物，并扩增较短的片段。在限制性内切酶消化后，基因组DNA必须完全变性为单链形式，因为亚硫酸氢盐介导的脱氨反应在双链DNA结构中的胞嘧啶残基上几乎无法进行。另一个关键点是亚硫酸氢盐处理必须彻底。如果已知未甲基化的胞嘧啶在亚硫酸氢盐测序中未转化为胸腺嘧啶，则表明亚硫酸氢盐处理未正确进行。此外，如果在未知区域中有大量胞嘧啶残基在亚硫酸氢盐测序中未转变为胸腺嘧啶，这极有可能是由于扩增了未完全转化的DNA，而非该区域所有...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢 Jennifer M. Lommel 女士和 Tara N. Rognan 对拟南芥（Arabidopsis）植株的培育与维护。本研究得到了圣路易斯大学的启动资金以及美国国立卫生研究院资助项目 1R15GM086846-01 和 3R15GM086846-01S1（资助对象：W. Xiao）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
材料与试剂
试剂
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参考文献
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