利用带有galK可筛选标记的重组工程法构建秀丽隐杆线虫（C. elegans）转基因

摘要

利用由fosmid携带的基因组DNA为Caenorhabditis elegans构建转基因，具有显著优势，因为可保留全部天然调控元件。本文描述了一种基于galK可筛选标记、通过重组工程构建转基因的简单且稳健的实验流程。

摘要

转基因动物的制备在科学研究中被广泛应用 秀丽隐杆线虫 研究包括利用GFP融合蛋白来分析目的基因的调控机制和表达模式，或构建特定基因的串联亲和纯化（TAP）标签版本以促进其纯化。通常通过将启动子置于GFP报告基因或目的cDNA的上游来构建转基因，这种方法往往能够产生具有代表性的表达模式。然而，该方法可能遗漏基因调控中的关键元件，例如3'非翻译区中的调控序列或可变启动子。此外，通常仅能通过此方法研究一种剪接变体。相比之下，使用由fosmid DNA克隆携带的线虫基因组DNA，很可能包含了大部分甚至全部参与基因调控的元件。 体内 从而能够更准确地捕获真实的表达模式和表达时序。为促进利用fosmid DNA构建转基因，我们描述了一种 E. coli 基于重组工程的方法，将GFP、TAP标签或其他目的序列插入基因组任意位置。该方法利用了 galK 基因作为重组工程中正向和负向筛选步骤的筛选标记，从而以高效率获得所需的修饰。此外，含有该基因的质粒 galK 基因两侧带有同源臂，可与常用的GFP和TAP融合基因连接，从而在构建GFP或TAP融合蛋白时使引物成本降低50%。这些质粒采用R6K复制起点，避免了对PCR产物进行繁琐的纯化步骤。最后，我们还展示了一种将目标序列整合到 unc-119 将标记插入到fosmid载体骨架中，使得该fosmid可直接注射或轰击进入线虫，以产生转基因动物。本视频演示了利用重组工程方法构建转基因的详细操作步骤。

方案

概述

用于转基因生物制备的许多转基因 秀丽隐杆线虫 由启动子序列和可能插入实验室构建的载体中的基因cDNA组成，这些载体由Andy Fire博士实验室提供 ¹尽管这些转基因在产生GFP报告基因或在特定模式下表达cDNA方面通常较为成功，但这些转基因可能缺少在基因表达调控中起重要作用的替代启动子、增强子元件以及3'非翻译区（UTR）元件 体内 ²例如，两者均 daf-12 和 fah-1 基因具有位于近端启动子区域之外的重要增强子元件，而仅包含启动子的构建体遗漏了这些元件 ^3,4,5此外，许多转基因构建体使用 unc-54 3'非翻译区，可防止被相应的微小RNA基因调控 ^6,7,8因此，利用包含大量线虫基因组DNA片段的转基因将有助于完整捕获所有启动子、剪接变体以及3'非翻译区调控元件。最近一项 秀丽隐杆线虫 已构建包含约40 kb基因组DNA片段且覆盖几乎整个基因组的fosmid文库。利用这些fosmid DNA克隆所携带的线虫基因组DNA，能够更准确地捕获特定基因的真实表达模式和表达时序。 ^2,8,9,10,11.

然而，操作大片段基因组DNA在实际应用中存在诸多挑战，例如使用标准分子生物学技术时会遇到极....

讨论

利用fosmid构建转基因可保留所有天然的启动子元件、剪接变体以及3'非翻译区（UTR）调控元件，从而获得更接近天然表达模式的转基因，或在其他方法失败时成功构建功能性转基因⁵。所获得的转基因可携带多种表位标签，包括GFP或TAP标签。

转基因的构建包含三个步骤，全部在SW106细菌菌株中进行¹⁵。第一步，通过重组工程将galK基因整合到待修饰的fosmid中特定目标位点，所用的PCR产物在其两侧带有与目标fosmid互补的同源臂，并在中间携带galK。我们开发的一项改进是，在galK盒中同时整合了用于FLAG-GFP或TAP标签的同源区域，使得同一对寡核苷酸可用于fosmid修饰的第一步和第二步，从而降低了寡核苷酸的合成成本。另一项进一步简化是使用基于R6K的载体，该载体无法在SW106细菌菌株中复制，因此无需对亲本载体进行酶切消化。第二步，用GFP或TAP等标签替换galK盒，从而将标签与fosmid上的目标基因融合。此步骤具有很高的可靠性，通常可获得大量正确修饰.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FosmidMAX试剂盒	Epicentre Biotechnologies	FMAX046
GoTaq	Promega Corp.	M7122
MOPS培养基	TEKnova, Inc.	M2120
0.132 M 磷酸钾溶液	TEKnova, Inc.	M2102
D-半乳糖	Sigma-Aldrich	G0750
2-脱氧半乳糖	Sigma-Aldrich	D4407
生物素	Sigma-Aldrich	B4639
亮氨酸	Sigma-Aldrich	L8000
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434
Phusion DNA聚合酶	New England Biolabs	F-530S
麦康凯琼脂基础	BD Biosciences	281810
阿拉伯糖	Sigma-Aldrich	A3131
氯霉素	Sigma-Aldrich	C1919
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S5136
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P5655
氯化钠	Sigma-Aldrich	S5886
甘油	Sigma-Aldrich	G2025
Bacto琼脂	BD Biosciences	214010