分离与 体外 激活 秀丽隐杆线虫 精子

摘要

本文介绍了一种从雄性 C. elegans 中分离并激活精子细胞的实验方案。通过切断雄性尾部可释放出精子细胞，加入蛋白酶可激活这些精子细胞。

摘要

雄性和雌雄同体是线虫秀丽隐杆线虫（C. elegans）中两种自然存在的性别形式。无性繁殖型的精子由雄性和雌雄同体个体共同产生。在配子发生的早期阶段，雌雄同体的生殖细胞会分化形成数量有限的精子——约300个——并储存在一个称为储精囊的小“囊”中。随后，雌雄同体会持续产生卵母细胞（oocytes）¹。相比之下，雄性在整个成虫期只产生精子。雄性产生的精子数量极多，占典型成虫体内总细胞数的>50%²。因此，从雄性个体中分离精子比从雌雄同体个体中更为容易。

由于X染色体自发不分离，自然产生的雄性仅占极小比例³。通过将雌雄同体与雄性杂交，或更方便地引入突变以产生雄性高频率（Him，High Incidence of Males）表型，是富集雄性群体的一些策略³。

通过观察尾部形态可以很容易地区分雄性和雌雄同体个体⁴。雌雄同体的尾部呈尖细状，而雄性尾部则呈圆形，并具有交配结构。

剪断尾部可释放出储存在雄性生殖道内的大量精子细胞。解剖操作在体视显微镜下使用27号针头进行。由于精子细胞不与其他细胞存在物理连接，液压可将雄性体内包括精子细胞在内的内含物排出²。

将雄性个体直接解剖于一滴“精子培养基”上。精子细胞对pH值的变化较为敏感，因此在精子培养基中使用具有良好缓冲能力的化合物HEPES。培养基中存在的葡萄糖及其他盐类有助于维持渗透压，从而保持精子的完整性。

精子细胞在减数分裂后的分化过程称为精子形成或精子激活。Shakes⁵，和 Nelson⁶ 先前研究表明，通过添加包括Pronase E在内的多种激活化合物，可诱导圆头精子细胞分化为精子。本文中我们证明 体外 精子形成过程 秀丽隐杆线虫 使用Pronase E处理精子细胞。

成功的精子形成是生育力的前提，因此在精子形成过程中存在缺陷的突变体均表现为不育。迄今为止，已有多个突变体被证实特异性地在精子形成过程中存在缺陷。⁷. 检查期间发现异常 体外 激活新的 Spe（精子发生缺陷）突变体将有助于我们发现参与该过程的其他因子。

方案

1) 富集雄性群体

1. 根据实验需求，可通过以下策略之一获得大量雄性个体：
   1. 通过将5只野生型雄虫与1只雌雄同体虫在NGM平板中央接种的小片OP50菌苔上交配，可获得大量野生型雄虫后代。下一代中约有50%为野生型雄虫。
   2. him-5(e1490）或 him-8(e1489) 雌雄同体产生大量雄性个体。 him-5 和 him-8 雄性具有生育能力，且精子形态和功能无明显缺陷。因此， him-5 或 him-8 雄性可用于 取而代之 许多实验所需的野生型雄性个体。

2）雄性的鉴定与分离

1. 检查蠕虫的尾部形态；雄性蠕虫的尾部呈圆形。
2. 挑选L4期雄虫，转移至接种有细菌的NGM平板 E. coli OP50 并培养一到两天。在无雌雄同体线虫的情况下培养雄虫，可防止精子流失，从而在实验过程中获得大量精细胞。
3. 解剖当天，将未交配的雄虫转移至不含细菌的NGM平板上，让其爬行数分钟。此步骤有助于去除虫体表面的少量细菌层 E. coli 黏附在蠕虫表面。或者，用移液器吸取少量M9缓冲液（6g Na₂HPO₄，3g KH₂PO₄，5 g NaCl，0.25 g MgSO₄₄.7H₂在表面皿中加入每升含 O 的缓冲液，然后将雄性个体转移至该缓冲液中。

3) 雄性个体的解剖与 体外 激活

1. 取一片载玻片，用记号笔在上面画一个小圆圈。在圆圈内加入30-50 μl的1X精子培养基（50 mM HEPES，25 mM KCl，45 mM NaCl，1 mM MgSO₄，5 mM CaCl₂，10 mM葡萄糖；pH 7.8）。疏水性圆圈有助于将精子培养基限制在圈内。
2. 将5-10只雄虫转移至精子培养基中。
3. 将载玻片置于显微镜下观察，双手各持一支连接27号针头的注射器。
4. 用其中一根针头固定线虫，另一根针头切断雄虫的后端以释放精子细胞。
5. 切断线虫通常会立即释放大量精子细胞。在体视显微镜下，精子细胞呈现为微小的“颗粒”状。然而，有时部分或大部分精子细胞可能仍保留在虫体残骸内。此时，可轻轻在载玻片上“拖动”虫体残骸，以促进精子细胞的释放。
6. 为激活精子细胞，可在含Pronase E（20 μg/ml）的1X精子培养基中进行解剖，并静置5分钟。
7. 实验过程中任何时候均不得让载玻片干燥。必要时可补充更多1X精子培养基。

4) 精子细胞和精子的观察

1. 将盖玻片轻轻放置在解剖样本的表面。
2. 在低倍镜（10X）下找到精子细胞的视野。
3. 通过转换至高倍镜——通常使用100X油镜——可观察精子细胞或精子的精细结构。

5) 代表性结果

雄性秀丽隐杆线虫（C.）分离的精子细胞的微分干涉相差（DIC）图像示例 elegans 如图1所示。精子细胞呈球形，细胞核明显。 体外 图2显示了激活的精子。

图1. C. elegans 精细胞的微分干涉差（DIC）图像。

图2. 微分干涉相差（DIC）图像 体外 活化的 秀丽隐杆线虫 精子

讨论

除了分析精子发生突变体（Spe突变体）外，本实验方案还有其他重要应用，例如分析精子形态随衰老的变化。通过本方案分离得到的精子细胞和精子可应用于其他下游实验，如对野生型和突变型精子进行免疫染色^{8, 9}、在载玻片上检测精子运动能力¹⁰、生理学指标测定^{9, 11}，甚至人工授精实验¹²。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
结核菌素注射器	BD Biosciences	309623	注射器：1 ml，针头： 27G × ½ in
组织标记笔	Zymed Laboratories, Inc.	00-8888
VWR VistaVision HistoBond 显微镜载玻片	VWR international	16004-406	尺寸： 75×25×1 mm
盖玻片	VWR international	48366045
蛋白酶	Sigma-Aldrich	P-6911