监测免疫细胞在腹腔感染数小时后对荧光标记朊病毒纤维的迁移作用

摘要

本文介绍了一种新方法，用于监测免疫细胞在腹腔接种后立即摄取和转运朊病毒的过程。该方法通过纯化来自感染脑组织的聚集性朊病毒纤维，并用荧光标记，随后追踪其从注射部位的摄取与移动情况，并鉴定介导这些过程的细胞类型。

摘要

存在一种异常构象的宿主编码型朊蛋白（PrPC），其具有抗蛋白酶特性，并表现出病理性和传染性，这是朊蛋白病的特征，例如鹿科动物的慢性消耗性疾病（CWD）和羊的瘙痒病。朊病毒假说认为，这种异常构象体构成了传染性朊病毒的大部分或全部成分。免疫系统在CWD和瘙痒病外周朊病毒致病早期事件中的作用已得到充分证实 ^1-3转基因和药理学小鼠研究表明，补体系统在感染早期维持和复制朊病毒方面具有重要作用 ^4-6. 体外 和 体内 研究还观察到树突状细胞对朊病毒的滞留作用 ^7-10，尽管它们在运输中的作用尚不明确 ^11-16巨噬细胞同样被认为参与了朊病毒病的早期发病机制，但这些研究主要关注感染后数周内发生的时间过程 ^3,11,17这些先前的研究还存在难以区分内源性PrP的问题^C 以及具有感染性的朊病毒。本文描述了一种半定量且无偏倚的方法，用于评估募集至接种部位的免疫细胞对朊病毒的摄取及其转运过程。聚集态的朊病毒棒状结构通过去垢剂溶解感染脑组织匀浆中的非聚集蛋白，并经蔗糖垫超速离心进行纯化。聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯亮蓝染色及蛋白质印迹分析证实，沉淀组分中富含高度纯化的朊病毒棒状结构。将荧光染料标记的朊病毒棒状结构经腹腔注射入小鼠体内，2小时后收集腹腔灌洗液、脾脏以及纵隔和肠系膜淋巴结中的免疫细胞，利用针对单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞以及B细胞和T细胞的多色流式细胞术标记物，检测各细胞亚群对朊病毒棒状结构的滞留情况。该检测方法首次实现了对获取并转运朊病毒的免疫细胞进行直接监测。 体内 感染后数小时内即可检测。该检测方法还能明确区分具有感染性的聚集态朙蛋白与宿主细胞正常表达的PrPC，而在其他检测系统中，二者的区分往往较为困难，易导致数据解读问题。本方案还可适用于其他接种途径（如口服、静脉注射、神经内注射和皮下注射）以及多种抗原（如偶联微珠、细菌、病毒和寄生虫病原体及蛋白质、卵蛋白等）。

方案

1. 纯化和标记朊病毒纤维

本方案改编自先前已发表的一项研究¹⁸

1. 将100克朊病毒污染的脑组织在900 mL预冷的匀浆缓冲液（HB，含320 mM蔗糖、150 mM NaCl和4 mM EDTA的1×PBS）中，使用商用搅拌器以最大速度匀浆1分钟，然后在冰上静置2分钟。重复此步骤三次。
2. 将匀浆液在4°C条件下以3000 × g离心10分钟。移去上清液并保存于冰上。将沉淀物重新悬浮于1 L HB中，并重复步骤1.1和1.2。
3. 合并上清液，在0°C条件下以100,000 × g离心60分钟。弃去上清液。
4. 将沉淀物重新悬浮于100 mL含2% Triton X-100的1×Tris缓冲盐水（TBST，含10 mM Tris-HCl、0.1 mM NaCl和1 mM EDTA）中。通过Bradford法或类似方法测定蛋白浓度，并用TBST调整至5 mg/mL。冰上冷却30分钟。
5. 在0°C条件下以100,000 × g离心30分钟。弃去上清液，用50 mL TBST洗涤沉淀一次，再用100 mL TBS洗涤一次。将沉淀物重新悬浮于含1% Sarkosyl和蛋白酶抑制剂混合物的100 mL 1×PBS中，在37°C下搅拌120分钟。
6. 将样品铺在900 mL 320 mM蔗糖溶液上，在10°C条件下以100,000 × g离心60分钟。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮于10 mL含2.3 M NaCl和5% Sarkosyl的溶液中。
7. 在冰上以70%最大功率超声处理样品，每次40秒，共5次，每次间隔1分钟。
8. 将样品分装至Eppendorf管中，每管1 mL，在4°C条件下以13,000 × g离心15分钟。沉淀物用TBS洗涤两次，储存于-70°C，或进行步骤1.9中的荧光染料偶联。
9. 使用一管纯化的朊病毒纤维，按照制造商说明书，与一管DyLight 649荧光染料进行偶联。
10. 通过透析或滤膜离心柱置换DyLight标记缓冲液为PBS。分装为20 μL，避光保存于-70°C，直至使用。

2. 朊病毒接种与细胞回收

本部分包括腹腔内接种朊病毒以及从腹膜、纵隔和肠系膜淋巴结及脾脏中回收细胞。

1. 使用前立即用 PBS 将荧光朊病毒纤维稀释 1:50。用拇指和食指抓住小鼠背部颈部的皮肤使其仰卧，轻轻转动小鼠使其面向操作者，并用小指固定尾巴，将小鼠后躯抬高过头部，使其略微倒置。
2. 使用 30G 胰岛素注射器，在距中线 1 cm 处、骶髂关节前方 1–2 cm 处皮下注射 100 μL 荧光朊病毒纤维。将针头以 45° 向内倾斜方向刺入皮肤 1 cm 深。以 1:50 稀释的荧光微珠或单独 PBS 作为对照。在分析前按照规定时间孵育小鼠。
3. 根据批准的动物护理与使用委员会规程实施小鼠安乐死。使用 12 mL 注射器和 25G 针头向腹腔内注入 10 mL PBS。纵向轻柔摇动尸体 1 分钟。用同一注射器配合 16G 针头从腹腔回收细胞悬液至 15 mL 锥形管中，并置于冰上保存，同时继续进行尸体解剖。
4. 用 70% 乙醇充分润湿尸体腹侧。用镊子在肋骨下方中线处提起皮肤，用剪刀剪开一小切口。由此开始，沿中线向头侧和尾侧分别切开 3–5 cm 长的切口，再从两端各向外侧做两条 2 cm 的横向切口。将皮肤剥离并固定，暴露腹腔和胸腔。小心切开包围腹腔的薄而透明的膜，并掀开胸廓以暴露纵隔。
5. 寻找并取出 2–4 个纵隔淋巴结，其位置略位于胸腺背外侧，靠近气管腹侧，且毗邻头臂动脉内侧。寻找并取出最多六个肠系膜淋巴结，它们嵌在将肠道锚定于腹后壁的柔软白色肠系膜组织中。寻找并取出脾脏，脾脏为一细长、深红色器官，位于腹部左侧、中线外侧且在肠道背侧。将淋巴结置于含 1 mL RPMI 1640 培养基的冰上保存，直至完成全部解剖。
6. 在塑料培养皿中，使用 1 mL 注射器的推杆将淋巴结碾碎并通过 40 μm 细胞筛网，滤入 3 mL RPMI 培养基中。用额外 2 mL RPMI 冲洗滤网，并将总共 5 mL 细胞悬液转移至 15 mL 锥形管。再用额外 5 mL RPMI 冲洗培养皿，并将冲洗液也转移至同一锥形管。以 250 × g 离心 5 分钟，弃上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL FACS 缓冲液（1× PBS、1% 牛血清白蛋白和 10 mM EDTA）中，转移至 1.5 mL Eppendorf 管。

3. 细胞染色与流式细胞术

以下是使用针对特征明确的免疫细胞表面标志物的荧光抗体来鉴定免疫细胞亚群的典型染色方案。所有抗体均在使用前立即用FACS缓冲液稀释。

1. 计数细胞，并将10⁶个细胞分装至离心管中。离心细胞（参见2.7），用1 mL FACS缓冲液重悬沉淀，洗涤2次。
2. 在冰上用100 μL含2 ng/mL大鼠抗小鼠CD16/32的溶液孵育细胞20分钟，以阻断内源性Fc受体。离心后用FACS缓冲液洗涤细胞。
3. 向每份样品中加入100 μL含1 ng/mL适当荧光标记抗体的溶液，冰上孵育1小时。对照细胞仅加入100 μL FACS缓冲液。离心后用FACS缓冲液洗涤细胞两次。
4. 将细胞重悬于1 mL ACK缓冲液（150 mM NH₄Cl、1 mM KHCO₃和0.1 mM EDTA）中，冰上孵育1分钟以裂解红细胞。离心后用FACS缓冲液洗涤细胞，再将细胞重悬于1 mL FACS缓冲液中。
5. 使用具备多色检测与分析能力的流式细胞仪收集细胞数据，通常配备405、488和633 nm激发激光器，以及五至十个荧光发射检测器。

4. 代表性结果：

我们从粗制的、感染朊病毒的脑组织匀浆中纯化出朊病毒纤维（图1）。对E2型麋鹿脑组织匀浆进行去垢剂溶解和超速离心（泳道1和2）可显著富集朊病毒纤维（比较泳道1和3），且该产物对蛋白酶K具有抗性（泳道4）。有趣的是，未经消化的纯化朊病毒纤维表现出的糖型谱与经消化处理的E2脑组织匀浆极为相似，表明朊病毒得到了显著富集。经相同处理的正常脑组织匀浆则未产生任何蛋白酶K抗性的PrP^C（泳道5和6）。

特定细胞群体的流式细胞术分析表明，抗原呈递细胞在注射后两小时内即归巢至腹膜，并滞留荧光微球和朊病毒纤维，其荧光强度显著高于PBS注射对照组（图2）。PBS处理的对照组小鼠腹膜中所获取的细胞均未显示高于背景水平的荧光（图2A-G），而注射微球（图2H-N）和朊病毒（图2O-U）的小鼠所获取的细胞则表现出显著荧光，尤其在单核细胞（图2I 和 P）、树突状细胞（图2K 和 R）和巨噬细胞（图2L 和 S）中明显，部分中性粒细胞（图2J 和 Q）以及较少的B细胞（图2T）也呈阳性。在接种后两小时，携带微球和朊病毒的单核细胞、树突状细胞及巨噬细胞亦可在纵隔淋巴结中检测到（分别为 图2AD 和 AK、AF 和 AM、AG 和 AN），而该部位几乎未见携带PrP^CWD的中性粒细胞、B细胞或T细胞（分别为 图2AE 和 AL、AH 和 AG 和 AI 和 AP）。我们在脾脏或肠系膜淋巴结中未检测到微球或朊病毒纤维（数据未显示）。总体而言，这些数据表明免疫细胞对朊病毒的转运方式与其他颗粒性抗原极为相似。

试剂	荧光染料	激发激光 (nm)	峰值发射波长 (nm)
朊病毒纤维	DyLight 649	633	674
1 μm 微球	AlexaFluor 660	633	685
抗体
CD11b	eFluor 450	405	450
	Phycoerythrin-Cy7	488	760
CD11c	R-Phycoerythrin	488	575
	Phycoerythrin-Cy7	488	760
Ly6C	Fluoroisothiocyante	488	518
Ly6G	R-Phycoerythrin	488	575
CD21	DyLight 488	488	518
B220	Allophycocyanin-Cy7	633	785
CD3	R-Phycoerythrin	488	575

表1. 荧光试剂的光谱特性

图1. 从感染性脑组织匀浆中纯化朊病毒纤维。 我们以慢性消耗性疾病（CWD）感染的鹿的10%粗制脑组织匀浆（E2，第1和2泳道）为起始材料，从中纯化出聚集态的朊病毒纤维（第3和4泳道）。粗制和纯化后的样品均表现出对蛋白酶K处理的典型抗性（第1–4泳道），而正常脑组织匀浆则无此特性（第5和6泳道）。印迹左侧显示了以Kd为单位的分子量标记。BH，脑组织匀浆。

图 2. 接种后两小时，免疫细胞从腹腔迁移至纵隔淋巴结的流式细胞术分析。 将 PBS（图 A-G 和 V-AB）、荧光微珠（H-N 和 AC-AI）或朊病毒纤维（O-U 和 AJ-AP）注射到小鼠腹腔内，接种后两小时从腹腔灌洗液（A-U）或纵隔淋巴结（V-AP）中收集细胞。第一列图示显示 PBS 处理小鼠（图 A 和 V）、荧光微珠（图 H 和 AC）及朊病毒纤维（图 O 和 AJ）处理组的细胞。荧光细胞（红色或绿色点）和总细胞（灰色点）的分布图展示了细胞相对大小（前向散射）、颗粒度（侧向散射）以及总活细胞中荧光细胞的比例。大量具有粒细胞特征的细胞保留了荧光微珠和纤维。细胞还经免疫细胞表面标志物抗体染色，并设门区分 Ly6G- Ly6C+ 单核细胞（图 B、I、P、W、AD 和 AK）、Ly6C- CD11c- CD11b+ Ly6G+ 中性粒细胞（图 C、J、Q、X、AE 和 AL）、Ly6G- Ly6C- CD11b+ CD11c+ 树突状细胞（图 D、K、R、Y、AF 和 AM）、Ly6G- Ly6C- CD11c- CD11b+ 巨噬细胞（图 E、L、S、Z、AG 和 AN）、CD3-B220+CD21+ B 细胞（图 F、M、T、AA、AH 和 AO）以及 CD21-B220- CD3+ T 细胞（图 G、N、U、AB、AI 和 AP）。单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞在腹腔内保留了荧光微珠和朊病毒纤维（分别为图 I 和 P、K 和 R、L 和 S），并将其转运至纵隔淋巴结（分别为图 AD 和 AK、AF 和 AM、AG 和 AN），表明这两种颗粒物的摄取和转运行为相似。中性粒细胞保留了大量微珠（图 J）和较少纤维（图 Q），但未能将其递送至淋巴结（图 AE 和 AL）。B 细胞保留并转运了部分纤维（图 T 和 AO），但几乎不保留微珠（图 M 和 AH）。T 细胞既未转运微珠，也未转运纤维（图 N、U、AI 和 AP）。

讨论

此处我们展示了一种用于标记和追踪朊病毒的实验方案 体内 这极大地促进了对外周朊病毒早期感染事件的监测。该方案显著改进了以往对朊病毒摄取监测的尝试。 体外 ⁹ 和 体内 ^3,12 通过预先标记高度富集的朊病毒接种物，以明确区分其与内源性PrP^C. 由于具有感染性的朊病毒和PrP^C 共享相同的初级氨基酸序列，因此制备针对朊病毒的特异性抗体一直存在困难。我们曾使用蛋白酶K消化并经甲醇沉淀的粗制脑组织匀浆，注射至PrP基因敲除小鼠体内，并用Dylight 649标记的抗-PrP抗体进行追踪（未发表数据）。这些实验获得的结果与本研究展示的结果几乎一致，但PrP基因敲除小鼠无法商业获取，且对朊病毒疾病不具易感性 ¹⁹ 且缺乏目前已知的唯一真正的朊病毒受体PrP^C该方案允许使用表达内源性PrP的常见实验小鼠品系^C，避免了使用PrP基因敲除小鼠可能带来的问题。

此处显示的数据表明，免疫细胞对...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
慢性消耗性疾病感染的麋鹿脑	科罗拉多州私人麋鹿养殖场		使用任何非人类朊病毒感染名脑组织
搅拌器	Oster 专业产品	6694-015	使用任何市售搅拌机
离心	Sorvall，赛默飞世尔科技	SS34 转子	使用任何可达到 3000 x g 且能容纳 ≥ 500 ml 体积
超速离心机	贝克曼库尔特公司	50.2 Ti 转子	使用任何可达到 100,000 x g 并能容纳 ≥ 500 ml 体积
Bradford 试剂	Sigma-Aldrich	B6916
完全迷你蛋白酶抑制剂混合物	罗氏集团	11 836 170 001
超声波破碎仪	Misonix	MP4000X	使用任何设定为最大功率约70%的探头超声仪或喇叭超声仪
DyLight 抗体标记试剂盒	赛默飞世尔科技公司	53050
微型离心机	Eppendorf	55430R	使用任何可达到13,000x的制冷微量离心机 g
离心过滤柱	EMD Millipore	Microcon YM-100	使用截留分子量为100 Kd的滤膜或透析膜
8-40周龄的FVB小鼠	查尔斯河实验室	207	使用任何近交系小鼠品系
1 μm 红色荧光微球	Phosphorex	2307	使用任意荧光微球 ≤ 10 μm
RPMI 1640 培养基	Invitrogen	11875-093
40 μm细胞滤器	Falcon BD	352340
荧光抗体	BD生物科学	各种	使用适合您实验应用的任何荧光抗体。
流式细胞仪	Dako	CyanADP	使用任何能够进行多色荧光检测的流式细胞仪