斑马鱼中运动神经元与靶向骨骼肌的配对膜片钳记录

摘要

幼年斑马鱼是首个能够同时对脊髓运动神经元及其支配的骨骼肌进行膜片钳记录的脊椎动物模型系统。本视频展示了用于识别节段性CaP运动神经元及靶向肌细胞的显微技术，以及对这两类细胞进行记录的方法学。

摘要

幼年斑马鱼是首个允许同时对脊髓运动神经元及其靶肌肉进行膜片钳记录的脊椎动物模型系统。这一优势直接源于这两种细胞类型的可接近性，以及能够根据形态和位置直观区分单个节段的CaP运动神经元。本视频展示了用于识别CaP运动神经元和靶肌肉细胞的显微方法，以及对每种细胞类型进行记录的技术流程。CaP运动神经元类型的确认可通过染料填充或其生物物理特性实现，例如动作电位波形和细胞输入电阻。运动神经元的记录通常可持续一小时，从而允许对多个不同的靶肌肉细胞进行长期记录。控制运动神经元的放电模式，可实现对神经肌肉接头处突触传递频率依赖性的测量。由于量子释放量较大且全细胞电压钳提供的噪声较低，肌肉中所有单量子事件均可被分辨。这一特性使得研究基本的突触特性成为可能，例如递质释放特性、囊泡回收，以及突触抑制和易化现象。相较于以往的神经肌肉模型系统——其中运动神经元通常由胞外电极刺激，且肌肉过大而无法进行全细胞膜片钳记录——这种体内制备方法具有显著优势。斑马鱼制备体系还可与多种技术手段相结合，包括转基因品系、吗啉寡核苷酸敲低、药理学干预以及体内成像。这些方法，结合越来越多由斑马鱼突变品系提供的神经肌肉疾病模型，为深入理解人类神经肌肉疾病开辟了新的途径。

方案

1. 鱼类配对记录的准备工作

1. 在开始操作之前，配制五种关键溶液，包括：浴液、含三卡因（MS222）的浴液、含甲酰胺的浴液、神经元内液和肌细胞内液。
2. 随后，选取一条72至96小时龄的单条斑马鱼幼鱼，并将其放入含三卡因（MS222）的浴液中。接触麻醉剂后一分钟内，鱼将不再对触碰产生反应。
3. 将鱼置于塑料培养皿上，在体视显微镜下使用双刃剃须刀片进行断头。
4. 将鱼转移至涂有Sylgard并盛满浴液的玻璃记录室中，通过将电蚀 sharpened 钨针插入脊索两端以固定标本。
5. 用一根针在鱼的头端附近制作一个皮瓣，以便用一对精细镊子夹持。用精细镊子夹住靠近头端针位的皮肤，缓慢向尾部方向剥离，以去除覆盖的皮肤。
6. 用3 mL含甲酰胺的浴液处理鱼体，持续3–5分钟，以阻断可能干扰记录的肌肉收缩。随后用正常浴液冲洗5次。用钨针侧面轻轻刮除5至6个节段的浅层肌肉组织。
7. 将鱼转移至位于法拉第笼内的直立显微镜下，以屏蔽电噪声。该显微镜配备固定载物台、长工作距离40倍物镜以及0.5至4倍的变焦功能。显微镜安装在电动X-Y平移台上，以便在高倍镜下移动标本，实现神经与肌肉之间的切换观察。微分干涉差（DIC）光学系统有助于清晰观察神经元。
8. 在0.5倍变焦下，使用大口径15微米移液管，通过连接3 mL一次性注射器施加负压，逐个移除覆盖的肌肉细胞，暴露脊髓。此操作重复于5至6个体节的骨骼肌区域。同一根大口径移液管也可用于去除腹侧肌肉的上两层，以暴露目标快肌骨骼肌。
9. 至此，配对记录的准备工作完成，将显微镜变焦调至约1.6倍。

2. 运动神经元与靶肌肉细胞的成对记录

1. 清洗后的脊髓节段被扫描以定位CaP运动神经元。每侧脊髓节段包含一个直径约10微米的大型CaP运动神经元。该神经元胞体呈泪滴状，位于脊髓节段边界尾端最末端附近的脊髓硬膜下方浅层。选择一个CaP神经元进行记录，并扫描相邻尾侧节段的腹侧靶向肌肉以检查其完整性。
2. 放置两个膜片钳电极用于记录，一个用于神经元，另一个用于肌肉。上方的电极具有较缓的锥形结构，以便穿透坚韧的脊髓硬膜，其尖端开口约为2微米；下方的电极具有更陡的锥形结构，用于骨骼肌的低电阻电压钳记录。
3. 将神经元电极以约30度的角度定位，穿透脊髓硬膜，位置在所选CaP神经元头侧约半个节段处。使用轴向驱动操纵器推进电极，同时施加约60毫米汞柱的轻柔持续正压。当电极穿透硬膜时，电极灌注液可能导致CaP神经元发生位移，需重新调整焦距。
4. 当电极接触CaP神经元胞体时，释放正压，通常会立即形成吉欧姆（gigaohm）级密封。然而，在某些未能形成密封的情况下，需施加轻微负压。密封形成后，将电极电位调节至-80 mV，并施加负压以破裂细胞膜。CaP神经元的特征表现为输入电阻为140至180兆欧，动作电位可超射至+40毫伏。通过在电流钳模式下逐步增加去极化电流脉冲直至诱发动作电位，来验证上述特性。
5. 随后，在高倍镜下使用X-Y电动平移台将显微镜重新定位至腹侧肌肉区域，并从目标视野中选择一个快肌细胞。
6. 在正压下将肌肉电极推进至目标肌细胞，释放正压后形成吉欧姆级密封。将电极电位调节至-50毫伏以失活钠通道，并通过轻柔抽吸破裂细胞膜。电阻下降至100至200兆欧，同时出现明显的大型电容性瞬变信号，提示已成功进入细胞。
7. 为检测配对记录效果，通过逐步增大电流注入使运动神经元去极化，直至诱发动作电位。此时，应在肌肉中诱发出终板电流。以1赫兹频率持续刺激运动神经元，可稳定诱发出无失败的终板电流。当刺激频率升高至100赫兹时，终板电流的幅度出现波动，并在刺激10秒内发生功能性耗竭。

3. 典型结果

通常，神经元记录可稳定持续长达一小时，但肌细胞会逐渐退化，表现为串联电阻增加。当出现这种情况时，应终止实验或对另一个肌细胞进行膜片钳制。所有记录应在一小时内完成。

图 1. 运动神经元动作电位（AP，上图）及相应肌肉终板电流（EPC，下图）的记录。CaP神经元的动作电位应超过+40 mV，EPC应在300 μsec内上升，并以时间常数小于1 msec的指数过程衰减。

名称	配方
浴液（单位：mM）	134 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl2, 1.2 MgCl2, 10 葡萄糖, 10 Na-HEPES, pH 7.8
含Tricaine的浴液	含0.02% tricaine的浴液
含甲酰胺的浴液	含2M formamide的浴液
神经元内液（单位：mM）	115 K-葡萄糖酸盐, 15 KCl, 2 MgCl2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 Mg-ATP, pH 7.2
肌细胞内液（单位：mM）	120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7.4

表1. 溶液。

讨论

我们一直采用斑马鱼配对记录技术（Wen 和 Brehm，2005）主要研究在高频刺激期间囊泡释放与再循环的过程。在运动缺陷突变体中，该过程受到破坏，其正常突触传递因关键突触组分的点突变而受损。例如，破坏突触后受体聚集体的突变（Ono 等., 2001, 2002, 2004）以及突触前递质合成的突变（Wang 等., 2008）会导致游泳动作不协调。配对记录可提供精确定位功能缺陷来源的信息，从而将行为、遗传与生理学联系起来。现在，通过在CaP运动神经元中使用适当启动子进行瞬时表达，有望进一步解析突触传递的潜在机制。通过这种方法，可特异性地在这些神经元中表达显性负性或突变基因，并确定其行为学和电生理学后果。全细胞记录构型的额外优势在于，可将可能影响囊泡再循环的试剂（如梭菌毒素和钙缓冲剂）透析至CaP胞体。由于胞体与肌肉之间的距离较短，扩散可在记录的时间范围内充分完成。该实验体系的潜力尚处于初步开发阶段。此阶段鱼体的透明性以及突触的表浅位置也便于光学工具的应用（Fetcho 和 O'Malley，1997；Fetcho 和 Higashijima，2004）。我们已成功在活体鱼中利用FM染料和基因编码指示剂（如Synaptophluorin）测量内吞和外吐过程（Li 等., 2003）。此外，荧光标记的毒素可用于标记突触蛋白，以实现对活鱼的成像（Ibanez-Tallon 等., 2004）。鉴于该实验体系的简便性，其在未来研究中具有广阔前景。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
气动换能器测试仪	Fluke Biomedical	DPM1B
0.002 x 3 英寸钨棒	A-M Systems	715000
Sylgard 184 弹性体	Dow Corning		应用厚度会影响 DIC 光学效果