需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

体内与体外衔接蛋白-网格蛋白相互作用的研究

14K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/2352

⸱

2011年1月26日

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Colorado State University

本文内容

摘要

网格蛋白介导的内吞作用依赖于衔接蛋白，这些蛋白协调货物选择和网格蛋白包被的组装。本文以酵母内吞衔接蛋白 Sla1p 为模型，描述了研究衔接蛋白与网格蛋白之间物理相互作用以及活细胞成像的方法。

摘要

一种主要的内吞途径始于网格蛋白包被小泡（CCV）的形成，这些小泡将货物从细胞膜表面转运至内体1-6。CCV的特征是其膜表面覆盖着由网格蛋白构成的多面体晶格结构，该结构作为机械支架发挥作用。在小泡形成过程中，网格蛋白包被由单个网格蛋白三腿复合物（triskelion）组装而成，后者是网格蛋白的可溶形式，由三条重链和三条轻链亚基组成7,8。由于三腿复合物本身无法直接与膜结合，因此网格蛋白结合适配蛋白至关重要，它们通过与脂质和/或膜蛋白相互作用，将正在形成的网格蛋白晶格连接至膜上9。适配蛋白还能包裹跨膜蛋白货物（如受体），并可与其他适配蛋白及CCV形成机制中的其他组分相互作用9。

目前已发现二十多种网格蛋白适配体，其中一些参与网格蛋白介导的内吞作用，另一些则定位于反式高尔基体网络或内体9。除HIP1R（酵母Sla2p）外，所有已知的网格蛋白适配体均可结合网格蛋白重链的N端β-螺旋桨结构域9。网格蛋白适配体为模块化蛋白，由折叠的结构域通过无固定结构的柔性连接区相连。这些连接区中含有短的结合基序，可介导与网格蛋白N端结构域或其他囊泡形成机制组分的相互作用9。目前已明确两种不同的网格蛋白结合基序：网格蛋白盒（clathrin-box）和W盒（W-box）9。网格蛋白盒的保守序列最初定义为L[L/I][D/E/N][L/F][D/E]10，但后续已发现多种变异形式11。W盒的序列模式为PWxxW（其中x为任意氨基酸残基）。

Sla1p（与肌动蛋白结合蛋白-1合成致死蛋白）最初被鉴定为一种与肌动蛋白相关的蛋白，在酵母细胞内吞位点处维持正常的肌动蛋白细胞骨架结构和动态过程中起必需作用12。Sla1p还能结合NPFxD内吞分选信号，对携带NPFxD信号的货物蛋白的内吞过程至关重要13,14。最近研究表明，Sla1p通过一种类似于网格蛋白盒（clathrin box）的基序LLDLQ（称为变异型网格蛋白盒，vCB）与网格蛋白结合，并作为内吞作用中的网格蛋白衔接蛋白发挥作用15。此外，Sla1p已成为活细胞荧光显微镜研究中广泛使用的内吞包被标志物16。本文以Sla1p为模型，介绍衔接蛋白与网格蛋白相互作用研究的常用方法，重点阐述活细胞荧光显微成像、GST沉降（pull-down）以及共免疫沉淀等技术。

方案

1. 在 SLA1 基因中插入 GFP 标签和筛选标记

采用Longtine方法17，将GFP标签直接融合至SLA1基因开放阅读框的3'末端（Sla1p的C末端），并同时用E. coli的kanr基因标记该基因，以便进行G418筛选。

  1. 以质粒 pFA6a-GFP(S65T)-kanMX618 为模板，使用以下引物通过 PCR 扩增生成 DNA 片段：正向引物为 5'-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3'，反向引物为 5'-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA TTC GAG CTC GTT TAA AC-3'。下划线序列对应于 SLA1 基因特异性片段，分别位于终止密码子上游（正向引物）和下游（反向引物）。通过琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 产物，随后进行 DNA 纯化。
  2. 在 YPD 培养基中培养 50 ml 的 S. cerevisiae SEY6210 菌株（MAΤα ura3-52, leu2-3,112 his3-Δ200, trp1-Δ901, lys2-801, suc2-Δ9 GAL-MEL）19，使其处于对数生长早期（OD600 = 0.2–0.6）。室温下以 2,000 × g 离心 3 分钟，用无菌水洗涤两次。
  3. 采用乙酸锂法20将第 1 步获得的 PCR 片段转化至细胞中。用 1 ml 无菌水洗涤细胞，加入 1 ml YPD 培养基，在 30 °C 摇床中孵育 4 小时。
  4. 将细胞涂布于 YPD-G418 平板上，筛选 G418 抗性转化子，在 30 °C 培养 2–3 天。挑取单菌落，并在 YPD-G418 平板上划线培养。
  5. 通过菌落 PCR 鉴定 GFP-kan 模块是否通过同源重组正确整合至 SLA1 基因序列中。使用一个与 SLA1 开放阅读框内序列互补的正向引物和一个与 GFP-kan 模块内部序列互补的反向引物。筛选 PCR 产物大小符合预期的菌落，并通过测序验证。
  6. 通过荧光显微镜检测菌落，确认其具有 GFP 荧光信号。

2. SLA1 基因中变异型网格蛋白盒（vCB）的突变

  1. 采用两步法在 SLA1 基因（核苷酸 2407-2415）中引入 LLDLQ 至 AAALQ 的突变15。
  2. 首先，通过 PCR 扩增 SLA1 的核苷酸 1207-1410 和 2427-2589 片段，并分别将这些片段克隆至 pBluescriptKS 的 NotI/BamHI 和 EcoRI/SalI 位点。
  3. 将含有 URA3 的 PCR 片段亚克隆至 BamHI/EcoRI 位点。
  4. 用 NotI/SalI 酶切所得质粒，通过凝胶纯化分离 URA3 片段，并利用乙酸锂转化法将其导入第一部分中构建的 Sla1-GFP 菌株，或导入 TVY614 菌株（MATa ura3-52 leu2-3112 his3-Δ200 trp1-Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 pep4::LEU2 prb1::HISG prc1::HIS3）21。
  5. 将细胞涂布于缺乏尿嘧啶的补充 SD 平板上。通过菌落 PCR 和测序确认 Ura+ 菌落中已正确整合 URA3 以替换 vCB 片段。
  6. 第二步，将 SLA1 的核苷酸 1207-2589 片段亚克隆至 pBluescriptKS 的 NotI/SalI 位点。使用 QuickChange-XL 定点突变试剂盒（Stratagene）将 vCB 区域的 LLDLQ 残基突变为 AAALQ。通过测序验证突变结果。
  7. 用 BsgI/AgeI 酶切所得构建体，并通过凝胶纯化分离含有突变 vCB 的片段。将 BsgI/AgeI 片段与 pRS313（HIS3）22 共转化至第二部分第 3 步获得的菌株中。
  8. 将细胞涂布于缺乏组氨酸的补充 SD 平板上。将 His+ 菌落复制至含有 5-氟乳清酸的琼脂培养基上，以筛选出突变序列已替换 URA3 的细胞，从而重建携带 LLDLQ 至 AAALQ 突变的 sla1 基因（sla1AAA）。通过菌落 PCR 和测序确认结果。

3. 荧光显微镜

  1. 将第1和第2部分构建的酵母菌株Sla1-GFP和sla1AAA-GFP接种于4 ml补充完全合成培养基（SD）中，于30°C避光条件下在旋转摇床上培养，直至OD600达到0.1–0.4。取1 ml培养物在室温下以4,000 × g离心1分钟。弃去约950 μl上清液，将菌体重悬于剩余液体中（约50 μl）。
  2. 取3 μl菌悬液滴加至显微镜载玻片上，加盖盖玻片，并避免光照。
  3. 将载玻片置于转盘共聚焦显微镜的100倍油镜物镜下进行观察。
  4. 使用明场照明或488 nm激光配合适当的滤光片，激发并检测GFP荧光信号，以定位细胞的正确焦平面。
  5. 对Sla1-GFP和sla1AAA-GFP细胞进行延时成像，曝光时间为500 ms（或适当参数），每秒采集一张图像，持续150秒。预期结果：GFP标记的斑点将出现在细胞限制膜的内表面，持续数秒后向细胞中心移动，同时信号迅速消失（提示包被结构解聚）。
  6. 选择图像中可见斑点出现、持续数秒后消失的区域，对每帧延时图像中的该区域进行裁剪。
  7. 将150秒延时图像中每一帧的裁剪区域沿时间轴对齐，生成该图像区域的线扫图（kymograph）。
  8. 根据斑点在线扫图中持续出现的秒数（即延时帧数）计算每个斑点的持续时间。注意，随着斑点逐渐消失，其轨迹应向细胞内部“弯曲”，反映内吞作用及包被结构的解聚过程。
  9. 比较野生型Sla1-GFP与突变型sla1AAA-GFP的斑点持续时间。重复实验以确认结果具有统计学显著性。预期结果：sla1AAA-GFP斑点的持续时间显著长于野生型（约80秒 vs 约30秒），表明其包被形成存在缺陷15。

4. 酵母胞质提取物和全细胞提取物的制备

  1. 在3升YPD培养基中接种适当的酵母菌株（如TVY61421），于30 °C摇床培养箱中培养至OD600 = 1-2。
  2. 在室温下以3,700 × g离心酵母培养物20分钟。弃去上清液，加入3-5 ml无菌水，反复吹打直至沉淀完全重悬。
  3. 在250 ml塑料烧杯中倒入约150 ml液氮。将酵母逐滴以环形方式加入液氮中进行速冻，避免冷冻颗粒发生凝集。切勿让颗粒融化，必要时可补充液氮。
  4. 用液氮预冷不锈钢搅拌机容器，并让液氮几乎完全蒸发。将冷冻的酵母颗粒加入冷的搅拌机容器中。用冷的橡胶塞封闭容器，研磨10秒。倒置容器3-4次以混匀内容物，重复研磨步骤两次。研磨后的冷冻酵母应呈粉末状。
  5. 用液氮预冷漏斗和50 ml锥形管。使用冷漏斗将研磨后的酵母转移至锥形管中。冷冻研磨的酵母可保存于-80 °C或立即使用。
  6. 为获得GST融合蛋白亲和实验（第5部分）所需的细胞质提取物，在15 ml锥形管中称取3 g冷冻研磨的TVY614酵母，并用3 ml室温缓冲液A（10 mM HEPES，pH 7.0，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM DTT）重悬，缓冲液中需含有蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）。
  7. 盖紧管盖并反复倒置数次直至完全解冻，然后置于冰上。
  8. 在4 °C下以300,000 × g超速离心20分钟。用移液器小心转移上清液（细胞质提取物）至另一锥形管中，避免扰动沉淀。将细胞质提取物保持在冰上。
  9. 加入100 μl缓冲液A中50%（v/v）的谷胱甘肽-Sepharose悬液。为便于移液，可剪去吸头末端。在4 °C旋转孵育15分钟，然后在4 °C以1,000 × g离心2分钟沉淀珠子，将上清液（细胞质提取物）转移至新管中。保留50 μl提取物作为输入对照。
  10. 为进行共免疫沉淀实验（第6部分）获得全细胞提取物，使用菌株TVY614（野生型SLA1）、在TVY614背景下构建的携带LLDLQ至AAALQ突变的sla1AAA菌株，以及携带SLA1基因缺失的sla1菌株（如GPY313023）。在锥形管中分别称取2 g相应的冷冻研磨酵母，并用2 ml室温缓冲液A重悬，缓冲液中需含有蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）和2% Triton X-100。
  11. 盖紧管盖并反复倒置数次直至完全解冻，然后在冰上孵育10分钟，期间定期通过倒置混匀。
  12. 将样品转移至微量离心管中，在4 °C以16,000 × g（微量离心机最高速度）离心15分钟。用移液器小心将上清液（全细胞提取物）转移至冰上的锥形管中，避免扰动沉淀。
  13. 加入100 μl缓冲液A中50%（v/v）的蛋白A-Sepharose悬液。在4 °C旋转孵育15分钟，然后在4 °C以1,000 × g离心2分钟沉淀珠子，将上清液（全细胞提取物）转移至新管中。保留50 μl提取物作为输入对照。

5. GST融合蛋白亲和实验

  1. 通过PCR扩增含有Sla1p变异型网格蛋白盒（vCB）（残基803-807）的片段，将其克隆至pGEX-5X载体中以获得pGEX-5X-vCB，并通过测序验证。
  2. 以pGEX-5X-vCB为模板，使用QuickChange-XL定点突变试剂盒（Stratagene），将vCB序列中的LLDLQ突变为AAALQ，获得pGEX-5X-vCBmut，并通过测序验证。
  3. 在大肠杆菌（E. coli，BL21 DE3）中表达GST以及GST-vCB和GST-vCBmut融合蛋白，使用谷胱甘肽-Sepharose纯化，用还原型谷胱甘肽洗脱，以PBS透析，并测定蛋白浓度。
  4. 标记3个微量离心管，分别为GST、GST-vCB和GST-vCBmut，每管加入1 ml PBS、30 μl 50%（v/v）谷胱甘肽-Sepharose悬液（溶于缓冲液A中）以及50 μg透析后的GST、GST-vCB或GST-vCBmut融合蛋白。
  5. 室温旋转孵育30分钟，使蛋白充分结合。
  6. 用PBS洗涤珠子2次，再用缓冲液A洗涤1次。向每管中加入1 ml酵母胞质提取物——按第4部分所述方法制备。
  7. 4 °C旋转孵育1小时，5,000 × g离心10秒使珠子沉淀，弃上清，用含0.1% Triton X-100的缓冲液A快速洗涤珠子3次，再用缓冲液A洗涤1次。
  8. 再次离心收集珠子，并用加样枪头尽可能吸除残留液体。此时样品可在-20 °C保存，以便后续继续实验。
  9. 每管加入15 μl 2× Laemmli上样缓冲液，96 °C孵育5分钟，5,000 × g离心10秒。
  10. 使用抗网格蛋白重链抗体进行免疫印迹分析。预期结果：网格蛋白可结合GST-vCB，但不结合GST或GST-vCBmut。同时通过SDS-PAGE分析样品，以确认各GST融合蛋白上样量相近。

6. 免疫共沉淀实验

  1. 标记3个微量离心管：WT（野生型SLA1）、sla1AAA和sla1Δ，并向其中各加入1 ml PBS、30 μl 50% (v/v)蛋白A-Sepharose悬液（溶于缓冲液A）以及2 μg兔抗Sla1p抗体。
  2. 室温旋转孵育30分钟。
  3. 用PBS洗涤珠子两次，再用含1% Triton X-100的缓冲液A洗涤一次。
  4. 向各管中分别加入1 ml在第4部分制备的相应总酵母提取物：SLA1、sla1AAA和sla1Δ。4 °C下旋转孵育1小时。
  5. 以5,000 x g离心10秒使珠子沉淀，弃上清液，然后用含0.1% Triton X-100的缓冲液A快速洗涤珠子3次，再用缓冲液A洗涤1次。
  6. 再次离心沉淀珠子，并使用加样枪头尽可能吸除液体。此时样品可在-20 °C保存，以便后续继续实验。
  7. 向每管中加入15 μl 2x Laemmli上样缓冲液，96 °C孵育5分钟，然后以5,000 x g离心10秒。
  8. 使用抗网格蛋白重链抗体对样品进行免疫印迹分析。预期结果：网格蛋白可与野生型Sla1p共免疫沉淀，但不能与sla1AAA或sla1Δ样品中的突变蛋白共沉淀。

7. 代表性结果

SLA1蛋白定位，显微镜图像；细胞分裂过程中蛋白质动态的延时成像。
图1. 通过活细胞荧光显微镜分析内吞位点处的Sla1p网格蛋白适配体。视频中的某一帧图像（左）及相应酵母细胞的时空图（右），这些酵母细胞表达Sla1-GFP或携带LLDLQ至AAALQ突变的sla1AAA-GFP。野生型和突变型Sla1-GFP均从内源SLA1位点表达。内吞位点表现为细胞周边分布的明亮斑点（左图）。白色线条之间的区域为生成时空图所对应的区域。视频采集速率为每秒1帧。请注意，在LLDLQ至AAALQ突变体（sla1AAA）中，Sla1-GFP的寿命较野生型（SLA1）更长。

蛋白质分析；免疫印迹图；网格蛋白重链检测；GST融合蛋白。
图2. 网格蛋白与Sla1p变体网格蛋白盒之间的物理相互作用。将GST与包含序列LLDLQ的Sla1p片段aa798-813（GST-vCB）、相应的AAALQ突变体（GST-vCBmut）或单独的GST分别融合后，结合至谷胱甘肽-Sepharose珠粒，并与野生型酵母细胞的胞质提取物孵育。结合的蛋白质被洗脱后，通过免疫印迹（IB）检测网格蛋白重链。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

网格蛋白包被小泡（CCV）参与内吞作用以及从trans高尔基体网络和早期内体的物质运输，这些保守的通路是真核细胞生物学的基本组成部分。本方法论文中描述的技术可用于研究介导CCV形成的分子机制，特别是衔接蛋白与网格蛋白之间的相互作用。GST融合蛋白亲和实验和共免疫沉淀实验可用于检测衔接蛋白（候选蛋白）与网格蛋白之间是否存在直接的物理结合。GFP标记结合荧光显微成像技术则可在活细胞中进行动态研究。酵母细胞尤其具有优势，因其易于进行遗传操作，可在衔接蛋白的内源基因中引入标签或突变，从而保持标记或突变蛋白的正常表达调控。同样，也可将网格蛋白或其他CCV组分标记RFP或其他荧光蛋白，以便在活细胞中开展双色成像研究16。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

D.F. 获得美国国家科学基金会（NSF）博士桥计划奖学金的支持。本研究中使用的显微镜部分由科罗拉多州立大学（Colorado State University）的显微成像网络核心基础设施资助项目支持。作者实验室中关于网格蛋白适配子的研究获得了科罗拉多州立大学（CSU）启动资金以及美国心脏协会（American Heart Association）资助号 09SDG2280525（授予 S.D.）的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
QuickChange-XL 定点突变试剂盒Stratagene
蛋白酶抑制剂混合物Sigma

参考文献

  1. Mellman, I., Warren, G. The road taken: past and future foundations of membrane traffic. Cell. 100, 99-112 (2000).
  2. Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).
  3. Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
  4. Bonifacino, J. S., Traub, L. M. Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes. Annu Rev Biochem. 72, 395-447 (2003).
  5. Ungewickell, E. J., Hinrichsen, L. Endocytosis: clathrin-mediated membrane budding. Curr Opin Cell Biol. 19, 417-425 (2007).
  6. Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem. 78, 857-902 (2009).
  7. Kirchhausen, T. Clathrin. Annu Rev Biochem. 69, 699-727 (2000).
  8. Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., Wakeham, D. E. Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 517-568 (2001).
  9. Owen, D. J., Collins, B. M., Evans, P. R. Adaptors for clathrin coats: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 153-191 (2004).
  10. Dell'Angelica, E. C., Klumperman, J., Stoorvogel, W., Bonifacino, J. S. Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin. Science. 280, 431-434 (1998).
  11. Dell'Angelica, E. C. Clathrin-binding proteins: got a motif? Join the network! Trends Cell Biol. 11, 315-318 (2001).
  12. Holtzman, D. A., Yang, S., Drubin, D. G. Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 122, 635-644 (1993).
  13. Howard, J. P., Hutton, J. L., Olson, J. M., Payne, G. S. Sla1p serves as the targeting signal recognition factor for NPFX(1,2)D-mediated endocytosis. J. Cell. Biol. 157, 315-326 (2002).
  14. Mahadev, R. K., Pietro, S. M. D. i, Olson, J. M., Piao, H. L., Payne, G. S., Overduin, M. Structure of Sla1p homology domain 1 and interaction with the NPFxD endocytic internalization motif. EMBO J. 26, 1963-1971 (2007).
  15. Pietro, S. M. D. i, Cascio, D., Feliciano, D., Bowie, J. U., Payne, G. S. Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: A novel role for the SAM domain. EMBO J. 29, 1033-1044 (2010).
  16. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123, 305-320 (2005).
  17. Longtine, M. S., McKenzie, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., Pringle, J. R. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14, 953-9561 (1998).
  18. Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., Philippsen, P. Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, 1065-1075 (1997).
  19. Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases. Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).
  20. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).
  21. Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
  22. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
  23. Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor. Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

网格蛋白衔接蛋白相互作用变异型网格蛋白盒GST下拉实验共免疫沉淀活细胞成像转盘共聚焦显微镜酵母胞质提取物Sla1p GFP标签内吞包被动态网格蛋白重链
体内与体外衔接蛋白-网格蛋白相互作用的研究
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。