网格蛋白介导的内吞作用依赖于衔接蛋白，这些蛋白协调货物选择和网格蛋白包被的组装。本文以酵母内吞衔接蛋白 Sla1p 为模型，描述了研究衔接蛋白与网格蛋白之间物理相互作用以及活细胞成像的方法。
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本文内容
摘要
摘要
一种主要的内吞途径始于网格蛋白包被小泡（CCV）的形成，这些小泡将货物从细胞膜表面转运至内体1-6。CCV的特征是其膜表面覆盖着由网格蛋白构成的多面体晶格结构，该结构作为机械支架发挥作用。在小泡形成过程中，网格蛋白包被由单个网格蛋白三腿复合物（triskelion）组装而成，后者是网格蛋白的可溶形式，由三条重链和三条轻链亚基组成7,8。由于三腿复合物本身无法直接与膜结合，因此网格蛋白结合适配蛋白至关重要，它们通过与脂质和/或膜蛋白相互作用，将正在形成的网格蛋白晶格连接至膜上9。适配蛋白还能包裹跨膜蛋白货物（如受体），并可与其他适配蛋白及CCV形成机制中的其他组分相互作用9。
目前已发现二十多种网格蛋白适配体，其中一些参与网格蛋白介导的内吞作用，另一些则定位于反式高尔基体网络或内体9。除HIP1R（酵母Sla2p）外，所有已知的网格蛋白适配体均可结合网格蛋白重链的N端β-螺旋桨结构域9。网格蛋白适配体为模块化蛋白，由折叠的结构域通过无固定结构的柔性连接区相连。这些连接区中含有短的结合基序，可介导与网格蛋白N端结构域或其他囊泡形成机制组分的相互作用9。目前已明确两种不同的网格蛋白结合基序：网格蛋白盒（clathrin-box）和W盒（W-box）9。网格蛋白盒的保守序列最初定义为L[L/I][D/E/N][L/F][D/E]10，但后续已发现多种变异形式11。W盒的序列模式为PWxxW（其中x为任意氨基酸残基）。
Sla1p（与肌动蛋白结合蛋白-1合成致死蛋白）最初被鉴定为一种与肌动蛋白相关的蛋白，在酵母细胞内吞位点处维持正常的肌动蛋白细胞骨架结构和动态过程中起必需作用12。Sla1p还能结合NPFxD内吞分选信号，对携带NPFxD信号的货物蛋白的内吞过程至关重要13,14。最近研究表明，Sla1p通过一种类似于网格蛋白盒（clathrin box）的基序LLDLQ（称为变异型网格蛋白盒，vCB）与网格蛋白结合，并作为内吞作用中的网格蛋白衔接蛋白发挥作用15。此外，Sla1p已成为活细胞荧光显微镜研究中广泛使用的内吞包被标志物16。本文以Sla1p为模型，介绍衔接蛋白与网格蛋白相互作用研究的常用方法，重点阐述活细胞荧光显微成像、GST沉降（pull-down）以及共免疫沉淀等技术。
方案
1. 在 SLA1 基因中插入 GFP 标签和筛选标记
采用Longtine方法17，将GFP标签直接融合至SLA1基因开放阅读框的3'末端（Sla1p的C末端），并同时用E. coli的kanr基因标记该基因，以便进行G418筛选。
- 以质粒 pFA6a-GFP(S65T)-kanMX618 为模板，使用以下引物通过 PCR 扩增生成 DNA 片段：正向引物为 5'-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3'，反向引物为 5'-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA TTC GAG CTC GTT TAA AC-3'。下划线序列对应于 SLA1 基因特异性片段，分别位于终止密码子上游（正向引物）和下游（反向引物）。通过琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 产物，随后进行 DNA 纯化。
- 在 YPD 培养基中培养 50 ml 的 S. cerevisiae SEY6210 菌株（MAΤα ura3-52, leu2-3,112 his3-Δ200, trp1-Δ901,....
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讨论
网格蛋白包被小泡（CCV）参与内吞作用以及从trans高尔基体网络和早期内体的物质运输，这些保守的通路是真核细胞生物学的基本组成部分。本方法论文中描述的技术可用于研究介导CCV形成的分子机制，特别是衔接蛋白与网格蛋白之间的相互作用。GST融合蛋白亲和实验和共免疫沉淀实验可用于检测衔接蛋白（候选蛋白）与网格蛋白之间是否存在直接的物理结合。GFP标记结合荧光显微成像技术则可在活细胞中进行动态研究。酵母细胞尤其具有优势，因其易于进行遗传操作，可在衔接蛋白的内源基因中引入标签或突变，从而保持标记或突变蛋白的正常表达调控。同样，也可将网格蛋白或其他CCV组分标记RFP或其他荧光蛋白，以便在活细胞中开展双色成像研究16。
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致谢
D.F. 获得美国国家科学基金会（NSF）博士桥计划奖学金的支持。本研究中使用的显微镜部分由科罗拉多州立大学（Colorado State University）的显微成像网络核心基础设施资助项目支持。作者实验室中关于网格蛋白适配子的研究获得了科罗拉多州立大学（CSU）启动资金以及美国心脏协会（American Heart Association）资助号 09SDG2280525（授予 S.D.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| QuickChange-XL 定点突变试剂盒 | Stratagene | |||
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma |
参考文献
- Mellman, I., Warren, G. The road taken: past and future foundations of membrane traffic. Cell. 100, 99-112 (2000).
- Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).
- C....
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重印与许可
