采用噬菌体展示文库筛选靶向骨组织的肽序列。研究目的是探讨这些肽对间充质细胞分化的影响，并确定其对骨再生的作用。
本文内容
摘要
摘要
两种新型合成肽可加速骨形成，并可通过胶原基质递送。本研究旨在探讨这些肽在单皮质骨缺损模型中对骨修复的影响。对间充质细胞进行肽处理后，碱性磷酸酶活性升高，细胞出现结节形成，并上调了 runx2、osterix、骨唾液酸蛋白和骨钙素基因的表达。用肽浸渍的胶原海绵促进了骨缺损的修复，而对照组效果较差。本研究结果表明，经肽处理的间充质细胞 体外 向成骨方向分化，且递送的肽类 体内 使用胶原海绵促进单皮质缺损的修复。
方案
1. 在体 筛选靶向长骨的噬菌体的生物淘选技术
噬菌体DNA被测序，并合成了相应序列的多肽。多肽合成时带有甘-甘-甘-丝-赖氨酸连接子（该连接子用于偶联荧光发色团，以帮助追踪多肽）。
- 一只10周龄的Balb/c小鼠被麻醉后暴露心脏。
- Ph.D-12 噬菌体展示肽库试剂盒（New England Biolabs，Beverly，MA）被用于 体内 生物淘选，10 × 10¹⁰ pfu，心内注射。
- 大约5分钟后，处死小鼠。暴露并解剖股骨，切除股骨两端，取出骨髓。
- 用 PBS 冲洗左侧股骨的内外部各 10 次，将股骨加入 ER2537 细菌中（称为非洗脱噬菌体，跳至步骤 6）。
- 用带有21号针头的注射器，以含2%脱脂奶粉的溶液冲洗右侧股骨髓腔10次，以去除未结合的噬菌体。结合的噬菌体用pH 2.2的盐酸-甘氨酸缓冲液从髓腔中洗脱，洗脱液用1 M Tris中和后加入ER2537细菌中，培养4.5小时以扩增噬菌体（称为洗脱噬菌体）。
- 细菌通过离心沉降去除，条件为10分钟 4°C，并在4℃下过夜沉淀噬菌体 4°C 通过加入PEG/NaCl溶液使噬菌体沉淀。经离心收集噬菌体后，加入1/6体积的PEG/NaCl溶液重悬并沉淀两次。最终沉淀物用含0.02% NaN3的TBS缓冲液重悬。
- 将洗脱和未洗脱噬菌体的扩增洗脱液分别注射到不同的小鼠体内，并按上述方法分离噬菌体。仅从注射了未洗脱噬菌体的小鼠中取出左侧股骨，并将股骨直接放入细菌中（见上述步骤4）。从注射了洗脱噬菌体的小鼠中仅取右侧股骨，先用HCl-甘氨酸缓冲液释放噬菌体，再加入细菌中（见上述步骤5）。
- 这 体内 生物淘选过程重复进行三次后，使用-98引物（随噬菌体展示试剂盒提供）对DNA进行测序。
- 扩增噬菌体库的细菌培养物，纯化并定量后，注射入第四只小鼠体内，随后重复测序。
- 为验证肽对骨和骨髓的特异性，按照上述方法分析了从肾脏和肝脏洗脱的噬菌体。在全部四轮实验中，这些器官中仅有少量噬菌体分布（少于10%）。
- 肽段合成为含有甘-甘-甘-丝-赖（gly-gly-gly-ser-lys）序列的结构，部分带有生物素标记，部分不带生物素标记，用于细胞和组织染色，以及后续实验 体内 工作。
2. 成骨细胞分化实验的间充质细胞培养
- 我们实验室分离的小鼠多能性骨髓基质（D1）细胞系克隆1 用于 体外 实验。细胞培养于添加了10%胎牛血清（Gibco 货号#16000-044）、每毫升50毫克抗坏血酸钠（Sigma 货号#A7631）以及100 U/mL青霉素G和100 mg/mL链霉素（Gibco 货号#15140-122）的低糖Dulbecco改良必需培养基（DMEM，Gibco 货号#11885-084）中。
- 培养物在以下条件下维持： 37°C 在含5% CO₂的湿润环境中2 水套式培养箱中培养并传代，直至细胞汇合度达到约90%。
- 细胞经胰酶消化后离心收集，计数，并以5×10⁵个/mL的浓度接种3 细胞/厘米²2 在经组织培养处理的塑料器皿中。
3. 培养细胞和组织的肽段染色
- 将 D1 细胞或骨髓细胞接种于包被有纤维连接蛋白或明胶的腔室载玻片中，加入含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基，培养 24 小时。
- 用 PBS 洗涤细胞。用 4% 多聚甲醛固定细胞/组织 30 分钟。
- 使用 0.5 M 甘氨酸（pH 7.5）封闭多余的醛基，处理 10 分钟。
- 通过加入 5% BSA+亲和素封闭液封闭细胞表面内源性亲和素和生物素受体，室温孵育 1 小时，用 PBS 洗涤一次，每次 5 分钟，再用 5% BSA+生物素封闭液封闭 1 小时。
- 向孔中加入 100 μM 生物素标记的 L7 和 R1 肽，孵育 30 分钟。
- 细胞用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟，加入 1:1000 稀释的 Alexa Fluor 链霉亲和素，避光孵育 30 分钟。
- 洗涤细胞后，用 Vectashield 封片介质封片，并在荧光显微镜下观察。
4. 碱性磷酸酶活性检测
- 使用碱性磷酸酶检测试剂盒（BioRad），按照制造商推荐的方法对单层细胞进行碱性磷酸酶比色法检测。
- 将 D1 细胞以 5 × 103 个细胞/cm2 的密度接种于 6 孔培养板中，并用 R1 肽处理，在第 4、8、12、16 和 20 天定量检测 ALP 活性。
- 制备细胞裂解液时，细胞层用 PBS 缓冲液洗涤三次，随后刮入 PBS 中，经超声处理并离心以去除细胞碎片。
- 取等体积的裂解液（100 μL）与 100 μL 新鲜配制的比色底物对硝基苯磷酸盐混合，于 37°C 孵育 30 分钟。
- 通过加入 100 μL 的 0.2 N NaOH 溶液终止酶反应。使用酶标仪（Bio-Rad）在 405 nm 处测定 ALP 活性。
- 采用 BioRad 蛋白检测试剂盒测定细胞裂解液的蛋白浓度，ALP 活性以每毫克蛋白每分钟生成的对硝基苯酚（nmol/min/mg 蛋白）表示。
- ALP 活性根据制造商说明书（Sigma, Inc.）进行计算。
- ALP 活性单位通过细胞裂解液的总蛋白含量（使用 BCA 法测定，Pierce, Rockford, IL）进行标准化，以每毫克总蛋白计。
5. 使用 L7 和 R1 进行间充质细胞分化
- 将亚融合的间充质（D1）细胞培养至约90%融合度，并用5 nM的L7和R1肽处理。
- 在处理后0.5、2、6、24和48小时收集细胞，并按照制造商说明使用Qiagen RNeasy试剂盒提取RNA。
- 逆转录（RT）反应在37°C退火10分钟，随后进行第一链cDNA合成（42°C，30分钟）和热失活（95°C，5分钟）。所得cDNA冻存于-70°C，待实时PCR检测时使用。
- 使用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒（Qiagen）进行实时PCR。反应体系包含25 μL SYBR Green预混液，以及成骨相关基因（如Runx2、Osterix、Osteocalcin、骨唾液酸蛋白）和Wnt信号通路基因（如b-catenin、LRP6、Wnt 5a、7b、10b、DKK1、OPG和RANKL）的正向与反向引物（300 nmol/L）（见表1）。
- 将3 μL未经稀释的RT反应所得cDNA直接加入最终反应体系中。96孔实时PCR板中包含质粒DNA标准品的六次十倍系列稀释，每个浓度设两个复孔。用光学粘性封膜（BioRad）密封反应板后，低速离心（300 ×g，5分钟）以确保充分混匀。
- 每个样本至少重复检测两次，使用iCycler仪器（BioRad Laboratories, Hercules, CA）进行分析。
- PCR程序包括AmpliTaq Gold DNA聚合酶的激活，随后进行40个循环：94°C变性30秒，相应退火温度退火30秒，72°C延伸30秒。每个样本的PCR循环阈值（CT）定义为荧光信号超过阈值线的循环数。阈值线设定在荧光曲线对数线性阶段，高于平均背景荧光10至20个标准差（SDs）的位置。通过回归分析计算标准曲线方程，即平均CT值对cDNA相对于总RNA的log10值的回归。目标基因的相对表达量以18S核糖体RNA作为成骨相关基因的内参，Wnt信号通路基因则以b-actin为内参进行标准化。
6. 在体 明胶海绵复合物的制备
- 采用无菌操作程序，使用自行设计的仪器制备明胶海绵圆柱体（Pharmacia & Upjohn 货号：09-0353-01），尺寸为直径 3 mm、长度 8 mm。
- 手术前 24 小时，将明胶海绵圆柱体浸入含有 L7 或 R1 肽（20 μM PBS 溶液）的溶液中进行负载，或仅用不含肽的 PBS 缓冲液处理。将明胶海绵圆柱体转移至无菌的 12 孔细胞培养板中，并在 -4°C 下过夜保存。
- 手术时，将培养板中的明胶海绵复合物从冰箱中取出，并置于冰上直至手术使用。
7. 骨缺损
- 所有动物实验程序在实施前均经弗吉尼亚大学卫生系统动物护理与使用委员会批准。取十只九月龄成年同源雄性Fischer 344大鼠（350–400 g），通过腹腔注射给予氯胺酮（每克体重50 g）和赛拉嗪（每克体重5 g）进行麻醉。
- 采用双侧手术入路暴露胫骨前内侧区域。该年龄段及更年长大鼠的胫骨前内侧区域横截面积、皮质骨面积、骨量、骨密度及轴向长度增长均不明显。在生理盐水冲洗条件下，使用气动磨钻（Hall高速钻；Zimmer）于该区域制备一个大小为3 mm宽×8 mm长的大型椭圆形单皮质骨缺损。
- 骨缺损处以明胶海绵处理，可选择性加入或不加入多肽。所有植入的支架尺寸均为3 mm（宽）×8 mm（长）×1.5 mm（深），通过轻柔敲击置入。术后未使用任何外部或内部肢体固定装置，动物在手术后立即恢复自由活动。
8. 组织学与形态计量学
通过大体形态学观察和拍摄的数字图像评估骨再生情况。
- 在损伤后3、5和12周处死大鼠，并采集胫骨，以定量分析损伤后新生骨组织的生成量。
- 仔细检查骨缺损后，将采集的胫骨置于10%中性缓冲福尔马林中固定，使用RDO快速脱钙液脱钙72小时，随后按常规程序处理并包埋于石蜡中，进行纵向切片。
- 通过大体观察和光学显微镜检查评估骨再生情况。
- 每种实验条件（即空缺损、仅明胶海绵、明胶海绵加R1肽）使用10只动物。8 mm的单皮质骨缺损约分布在40张组织切片上，每张切片厚8 μm。在这40张切片中，我们至少选取6张切片用于新生骨量的定量分析。
- 所有组织切片均用苏木精/伊红（H&E）染色，该染色可标记类骨质基质。
- 所有切片均通过显微镜进行评估。
9. 骨修复
概述
骨修复显然是肌肉骨骼组织再生领域中一个极为重要的研究方向。靶向骨组织的肽类在骨科手术实践中可能具有重要应用价值，尤其是在假体植入方面，这些假体可能持续留置数年甚至数十年。骨趋向性因子的仿生特性有望推动组织工程领域以及骨科假体手术的技术进步。将骨靶向因子整合入合成或天然聚合物中，可能有助于提高细胞黏附的特异性，从而募集正在修复与再生过程中的组织内的内源性细胞。另一个研究目标是验证我们通过独特方法鉴定出的骨靶向肽是否具有相应功能 在体 噬菌体展示文库的生物筛选将结合从骨组织和骨髓中分离的细胞，并具有调控成骨作用的潜力 体外 和骨再生 体内.
在本实验中，我们利用天然和合成聚合物基质将多肽递送至大鼠股骨缺损部位，并通过组织学、生物化学、基因表达、显微CT及生物力学等方法评估骨再生情况，以阐明多肽在骨再生过程中的活性细节。该策略的进一步发展有望发现并开发出靶向骨骼的生物活性化合物，并通过在细胞和分子水平上已明确的生物学机制促进骨修复。
染色
多肽经生物素标记后合成，以确定其与间充质细胞的结合及定位情况。采用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的亲和素对培养细胞上多肽的结合进行显微定位。 体外这些肽在培养物中可结合间充质细胞，也可结合小鼠肋骨组织切片中的骨组织和骨髓。 体外 (图1).
冯库萨染色
从骨髓中克隆出一种间充质细胞（D1），并用于测定肽类对细胞的成骨作用 体外细胞经L7和R1肽处理，以观察细胞形态和基因表达的变化。第4天时，细胞开始聚集，随着时间推移，聚集体逐渐增大并形成结节，该细胞行为模式与体外培养的骨细胞相似。 图2 ).
向细胞中添加肽L7或R1可增强von Kossa染色效果。随后，在培养过程中用不同浓度的肽L7或R1处理细胞，最长持续16天。结果确定，5 nM肽在体外作用最为显著。in vitro。经肽处理的培养物中碱性磷酸酶活性增加了2至3.5倍，增幅取决于肽的浓度及培养中的处理时间。
实时荧光定量 PCR
使用L7和R1肽处理的细胞通过实时PCR分析了两种已知的成骨细胞转录因子（Osterix和Runx2）以及三种骨基质蛋白（骨唾液酸蛋白、骨钙素和I型胶原）的基因表达。R1处理组显示出Osterix和Runx2基因表达的上调，而I型胶原基因表达保持不变。L7处理组则表现出BSP和骨钙素基因表达的增加，同时I型胶原基因表达也有所上调。这表明这两种肽均能影响与间充质细胞培养中成骨作用起始和进展相关的基因。
治疗 体外 使用肽R1和L7处理细胞培养物，利用间充质细胞发现其具有促进骨形成的同化作用。骨保护素与RANKL的比值升高，表明破骨细胞（即骨吸收细胞）的募集减少。肽处理还可上调与骨形成相关的基因表达，同时降低抑制成骨作用的因子水平。
组织学
为了确定骨量，我们将骨组织切片进行暴露处理 μLtra紫光从而产生自发荧光。这为定量分析提供了骨组织与非骨组织之间更高的对比度 2使用明场和紫外光对切片进行拍照图3使用尼康显微镜和尼康数字成像系统在相同放大倍数（10倍物镜）下进行成像，UV光由尼康数字成像系统提供。所得数字图像采用Metavue成像软件（Molecular Devices）进行分析。我们选择一个固定的矩形感兴趣区域（ROI），其中包含8 mm的单皮质骨缺损。每次分析时，通过手动将该矩形区域准确放置于图像的相应位置，确保损伤部位始终位于此ROI内。H&E阳性像素使用魔棒工具并设置颜色容差进行部分自动化选取。该容差设置所选中的绿色像素范围与H染色中骨组织的组织学形态完全一致&E染色切片。H的总数&记录每张切片的E阳性像素数。对每个胫骨样本的各个切片像素数取平均值，并基于这些平均值计算组内和组间差异。随后，根据新生皮质骨的含量对所有样本的面积进行比较。 图4 ).
通过量化切片中骨组织的存在情况，评估明胶海绵联合肽治疗组与单独使用明胶海绵组的骨缺损修复效果。填充明胶海绵联合R1肽的缺损显示出最显著的皮质骨修复，在术后3周、5周和12周分别增加了10倍、7倍和2倍。与单独使用明胶海绵相比，明胶海绵联合肽组在皮质骨修复方面的差异在3周和5周时最为明显，表明该肽可促进皮质骨再生（图5）。
10. 成骨肽的促合成代谢作用
OPG/RANKL 比值大于 RANKL/OPG 比值，这表明这些肽可能对成骨细胞具有直接作用，并调节骨吸收。
合成肽可能相较于大分子具有一些优势，例如制备速度快、分子稳定性高、保质期长以及潜在的治疗应用价值。在通过调控细胞因子和生长因子来调节骨量丢失与骨再生方面，已取得显著进展。这些具有亲骨性的肽类分子可能为现有促进骨形成和骨再生的疗法提供有吸引力的替代选择。
图1. 小鼠肋骨组织切片中肽与骨髓和骨的结合 体外.
图2. 间充质细胞（D1）在肽处理后形成结节。
图3. 使用成骨肽L7和R1进行骨修复的组织学结果。
图4. 骨组织切片经H&E染色后在紫外光下观察，可产生自发荧光。此方法可增强骨组织与非骨组织之间的对比度，便于定量分析。
图5. 组织学切片中骨量的定量分析显示，5周时皮质骨修复程度最大，变化达10倍，3周和5周时分别为7倍和2倍，表明该肽可促进皮质骨再生。
披露
本视频的制作由 New England Biolabs, Inc 赞助，该公司生产了本文所使用的一些试剂。
致谢
美国国立卫生研究院，AR53579，骨形成：骨趋向性肽的增强作用
美国国立卫生研究院，AR056422，成骨肽的促合成代谢效应
美国国立卫生研究院，T32 AR050960，肌肉骨骼组织修复与再生
美国国防部，PC051219，核仁素：前列腺癌与骨髓内皮细胞黏附的新介质
美国国防部，PC061508，前列腺癌转移细胞与骨髓黏附介质
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 噬菌体展示肽库试剂盒-Ph.D-12 | 新英格兰生物实验室 | E8110S |
参考文献
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重印与许可
