啮齿类疟原虫遗传杂交实验方案

摘要

通过将两种基因型不同的寄生虫喂给蚊子，可实现啮齿类疟原虫的遗传杂交。在允许蚊子叮咬感染小鼠后，从小鼠血液中分离并克隆重组子代。本视频展示了如何对Plasmodium yoelii进行遗传杂交，该方法也适用于其他啮齿类疟原虫。

摘要

疟原虫对疟疾药物的反应差异及其致病性差异具有重要的生物学和医学意义。连锁图谱分析已成功鉴定了导致鼠类^1-3和人类^4-6疟原虫多种性状的基因或基因座。疟原虫约氏疟原虫（Plasmodium yoelii）是自非洲野生啮齿类动物中分离出的多种疟原虫之一，现已适应在实验室条件下生长。该物种再现了人类疟原虫的许多生物学特征；同时，研究人员也已为该寄生虫开发了微卫星和扩增片段长度多态性（AFLP）等遗传标记^7-9。因此，可开展鼠疟原虫的遗传学研究，以补充对恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）的研究。本文中，我们演示了约氏疟原虫（P. yoelii）遗传杂交技术的操作方法，该技术最初由爱丁堡大学的大卫·瓦利克（David Walliker）、理查德·卡特（Richard Carter）及其同事率先建立¹⁰。

在P. yoelii及其他啮齿类疟原虫中进行遗传杂交，需将含有两种基因型不同且表型存在差异的克隆配子体的接种物感染小鼠Mus musculus，并在感染后第4天让蚊子吸食感染小鼠的血液。在蚊子吸血前，需通过显微镜确认小鼠血液中存在雄性和雌性配子体。吸血后48小时内，在蚊子中肠内，单倍体配子体分化为雄性和雌性配子，完成受精并形成二倍体合子（图1）。在合子发育为动合子的过程中，似乎会发生减数分裂¹¹。若合子是由两种基因型不同的寄生虫配子通过异体受精形成，则可能发生遗传物质交换（即同源染色体间非姐妹染色单体的染色体重新分配和交叉互换；图2），导致同源位点上的遗传重组。每个合子经历连续两次核分裂，产生四个单倍体核。动合子进一步发育为卵囊。卵囊成熟后，会生成数千个子孢子（杂交后代），并释放至蚊体血腔中。从蚊子唾液腺中收集子孢子，并将其注射入新的小鼠宿主体内，使其进行红细胞前和红细胞内的发育。在进行遗传连锁图谱分析之前，需对红细胞内的寄生虫形态进行克隆和分类，以区分亲本株系的特征。亲本克隆的单独对照感染操作与遗传杂交的制备过程相同。

方案

所有将用于动物的材料均须采用无菌技术，以避免意外将外源性感染性因子引入小鼠体内，从而干扰实验结果。

1. 实验小鼠红细胞期疟原虫感染

1. 在室温下，解冻两管待杂交的冻存疟原虫红内期样本。本示例中使用的两种鼠疟原虫株分别为 Plasmodium yoelii yoelii 和 Plasmodium yoelii nigeriensis。
2. 将一支注射器安装22–30号（G）针头，并抽取400 μL无菌级药用PBS（pH 7.4）。
3. 使用同一支注射器，再抽取100 μL解冻后的感染血液；将注射器上下颠倒，使内容物充分混匀。（可选：可先使用移液器将PBS和感染血液转移至收集管中，再吸入注射器用于注射）。
4. 将200 μL含疟原虫的溶液直接注射入小鼠腹腔。操作完成后，将注射器丢弃至锐器盒中。（有关实验小鼠的饲养管理，参见补充材料）。通常，接种量的标准体积为100–500 μL，具体取决于原始冻存材料中的寄生虫感染水平。
5. 将待杂交的两种疟原虫株分别注射至两只小鼠体内。注射后3至5天，小鼠在显微镜下可检出阳性。当寄生率达到1%–5%时，进入下一步操作。

2. 小鼠混合克隆感染

1. 在混合克隆感染前，采集分别感染不同寄生虫株的两只供体小鼠的尾部血液，通过吉姆萨染色薄血涂片....

讨论

我们展示了在啮齿类疟原虫Plasmodium yoelii中进行遗传杂交的技术，该方法同样适用于其他啮齿类疟原虫的遗传杂交实验。在进行杂交前，通常需先用单一亲本克隆感染小鼠，以确认亲本寄生虫成功传播，确保亲本具有产生功能性配子的能力。

蚊虫成功传播疟原虫受到多种因素影响，包括昆虫饲养室的温度、所用啮齿类疟原虫的种类以及血液阶段寄生虫的接种剂量（接种量）。虽然通常在19–21°C条件下即可实现P. berghei的传播¹³，但P. yoelii和P. chabaudi的传播通常在23–25°C下进行¹⁴。P. berghei的动合子在低于16°C或高于24°C的温度下无法发育为卵囊¹⁵。除温度外，接种量也会影响疟原虫在血液中的增殖速率。尽管注射较大剂量的接种物（5 × 10⁶ 个感染性红细胞或更多）可在感染早期产生更高的寄生虫血症，但这并不一定导致更多的配子体数量或更高的蚊虫感染性。Gadsby等人（200.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Glyerolyte 57 溶液	Cenmed	4A7833
小鼠 小家鼠	查尔斯河实验室		雌性，近交系，Balb/C 品系
热灭活小牛血清	Invitrogen	26010-066
磷酸盐缓冲液（PBS）溶液	Invitrogen	10010-072	pH 7.4；细胞培养级
疟原虫 疟原虫 y–lii y–五十二 17XNL(1.1)	MR4	MRA-593	由 DJ Carucci 提供
疟原虫 疟原虫 y–lii nigeriensis N67	MR4	MRA-427	由 W Peters、BL Robinson、R Killick Kendrick 提供
蚊子 Anopheles stephensi	MR4	MRA-128	由 MQ Benedict 沉积
Cellometer 自动细胞计数仪	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 一次性血细胞计数板	Nexcelom Bioscience	Cellometer CP2
高纯度PCR模板制备试剂盒	罗氏集团	11 796 828 001
氯化钙	Sigma-Aldrich	C5670	经细胞培养测试；经昆虫细胞培养测试
改良吉姆萨染色	Sigma-Aldrich	GS500
盐酸氯胺酮	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	药品级；浓度达 100 mg/mL
氯化钾	Sigma-Aldrich	P5405	经细胞培养测试；经昆虫细胞培养测试
氯化钠	Sigma-Aldrich	S5886	经细胞培养测试；经昆虫细胞培养测试
二水合柠檬酸三钠	Sigma-Aldrich	S4641
赛拉嗪	Akorn 公司	4811-20ml	药品级；浓度至20 mg/mL
玻璃棉	VWR 国际公司	32848-003
玻璃毛细管（1 μL	VWR 国际公司	53440-001
血细胞计数板	VWR国际	15170-168	完整腔室组件
匀浆器	VWR 国际公司	KT749520-0090	1.5 mL 配套研磨杵与管
补充材料： <李>实验室小鼠的饲养管理 实验室蚊虫的保种与维护–s <李>吉姆萨染色薄血涂片的显微镜检查 红细胞密度的测定 实验室小鼠的饲养与管理 使用5至8周龄的近交系实验室小鼠BALB/c雌性个体进行研究。小鼠饲养在标准的实底聚碳酸酯笼具中，笼顶为金属网盖，配备饲料盒和饮水瓶。小鼠维持在恒定温度（25 ± 1°C）在12小时光照：12小时黑暗循环条件下饲养。小鼠可自由摄食2018S Harlan Teklad Global 19%蛋白挤压颗粒啮齿类动物饲料（可高温灭菌，购自Harlan-Teklad），并自由饮用酸化饮用水。动物实验均依照美国国立过敏与传染病研究所动物护理与使用委员会在LMVR11E号方案（美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）下制定的指南与规定进行。 实验室蚊虫的保种与维护–s 蚊子–来自实验室培育的斯氏按蚊（Anopheles stephensi）种群。成虫饲养于尼龙网笼中，置于温度和湿度受控的房间内（23至25）°C 为 疟原虫 y–五十二 和 疟原虫卡氏亚种，以及19到21°C 代表 疟原虫伯氏株；80%至95%湿度；12小时光照：12小时黑暗循环）。成蚊–幼虫以含10%葡萄糖和2.00%对氨基苯甲酸（PABA）的水溶液饲喂。为获得高质量的成虫，将500条幼虫在1 L蒸馏水中低密度培养于1,000 cm²的容器中。3 敞口培养皿中加入约1 mg碳酸氢钠。孵化后，幼虫喂食tetramin粉末（PETCO），直至发育至蛹期，随后转移至成蚊饲养笼中羽化。 吉姆萨染色薄血涂片的显微镜检查 使用干净的剪刀剪下感染小鼠的尾尖（1.0 mm）’s 尾部。放置一滴（0.5–1.0） μ将尾部血液约 L 滴于干净的载玻片上。小鼠出血将在 1–2 分钟内停止。取一片干净的推片置于血滴上方，保持 45° 角° 相对于载玻片成一定角度，使血液吸附至推片的整个宽度。手持载玻片，迅速而平稳地向前推动推片，形成薄血膜。待血膜自然干燥后，将玻片浸入无水甲醇中固定。再次空气干燥后，滴加吉姆萨染液（10%吉姆萨染料溶于蒸馏水）覆盖血膜。室温下染色10–15分钟，随后用自来水小心冲洗玻片，并再次空气干燥。使用光学显微镜在油镜下（100倍物镜，总放大倍数1000倍）观察感染红细胞（iRBC；感染红细胞形态见图3）的数量，并计算寄生虫血症率（每计数100个红细胞中的iRBC数量）。不同疟原虫株系的生长速率和致病性存在差异。注射后24小时可开始监测红细胞期寄生虫血症水平，具体时间取决于接种的红细胞期疟原虫剂量。例如，当注射剂量为10时，小鼠在24小时后即可检出显微镜下阳性结果7 感染的红细胞腹腔注射或106 受感染的红细胞静脉注射。 红细胞密度的测定 与寄生血症水平类似，感染小鼠的红细胞（RBC）密度在感染过程中会不断变化。应在单克隆和混合克隆感染实验以及克隆实验开始前1-2小时内测定RBC密度。测定RBC密度有两种方法：使用Neubauer血细胞计数板进行手工计数，或使用Cellometer（Nexcelom Bioscience）进行自动计数。两种方法均需采集1 μ用玻璃毛细管（VWR）采集小鼠尾部血液 10 L，加入 10 mL PBS 中稀释，充分混匀。使用血细胞计数板（Neubauer）时，加载 20 μ将悬浮液的L滴加到血细胞计数板上。将血细胞计数板置于配备10倍物镜的光学显微镜下。血细胞计数板包含一个分为9个大方格的网格，其中四个角的大方格各自进一步分为16个小方格。计数四个角的每个大方格中16个小方格内的细胞总数。为避免计数偏差或重复计数跨越网格线的细胞，当细胞与网格线重叠时，仅计数与上边界和左边界相接的细胞 "在" 如果它与上方或右侧的线条重叠 "出" 如果细胞与下方或左侧的线重叠，则不计入。估算一个中方格内四个小方格的细胞总数，再除以0.00625（每个小方格的体积为6.25 nL），即可得到每微升（μL）的细胞数量。μL）。根据此数据，乘以10,000（稀释倍数），计算最终红细胞密度。用蒸馏水和70%乙醇清洗盖玻片和计数室，自然晾干。或者，加入20 μ将悬浮液的L量移至Cellometer计数板载玻片上。将载玻片插入Cellometer滑片室（读数仪）中。启动Cellometer软件，选择相应的程序 "红细胞" 选项，并输入10,000的稀释倍数。记录红细胞密度。