本文介绍一种高效冻存和复苏皮层脑组织块的方法，以建立高度富集的神经元培养物。该简单方案为后续建立神经元、星形胶质细胞及神经前体细胞培养提供了灵活性。
本文内容
摘要
摘要
本研究中，我们概述了一种标准化的方案，用于成功冻存和复苏大脑皮层组织块，以建立高度富集神经元的培养体系。该方案所用的冻存液为10%二甲基亚砜（DMSO）溶于Hank's平衡盐溶液（HBSS）中。将皮层组织块转移至含有冻存液的冻存管中，并置于程序降温冻存盒内以-1°C/min的速率缓慢冷冻。解冻后对冻存组织块进行处理和解离， consistently 获得富含神经元的培养物，这些培养物在培养最初5天内表现出快速的神经突生长，并在10天内形成显著扩展的神经元网络。使用星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经元标志物β-III类微管蛋白进行免疫细胞化学染色，结果显示培养物中含有大量神经元和星形胶质细胞。组织块解离后生成的神经前体细胞培养物可迅速形成扩增的神经球，在诱导分化条件下可产生大量神经元和星形胶质细胞。该简易冻存方案可快速、高效且低成本地保存大脑皮层组织块，为后续建立神经元、星形胶质细胞及神经前体细胞培养体系提供了更大的灵活性。
方案
1. 皮质组织块的冷冻保存
材料准备
- 通过将10X储存液与无菌水按1:9比例稀释，制备1X汉克斯平衡盐溶液（HBSS）。将HBSS储存于4°C。
- 通过将DMSO与HBSS按1:9比例稀释，制备10% DMSO冻存液。冻存液应在冷冻保存前新鲜配制，并在使用前于4°C冷藏保存。
- 使用钢制剃须刀片对组织进行系统性切割。使用前，将刀片浸入70%乙醇中消毒2小时。在组织处理前立即用无菌水冲洗刀片3次。避免将刀片在无菌水中放置过久，因其易发生氧化。
- 将冻存管（2.5 mL）装入Nalgene冻存盒，然后移入无菌生物安全柜中。向每支冻存管中加入1 mL预冷的冻存液。随后将冻存盒置于4°C环境中至少2小时。
清洗、切碎与冷冻
- 将待冷冻的脑组织清除脑膜和血管。在冰袋上操作，使用无菌针头小心去除组织上的杂质。清理后的组织用冷的HBSS轻轻冲洗，并转移至新的培养皿中进行切碎。
- 在冰袋上操作，使用灭菌剃刀片迅速将组织切成约1 mm3大小的组织块。每次处理少量已清理的组织有助于更好地控制切碎过程，从而获得更均匀的组织块尺寸。
- 将切碎的组织缓慢加入含有50 mL HBSS的50 mL锥形管中。用HBSS轻轻冲洗培养皿，以收集残留的组织块。静置使组织块沉降至管底，形成疏松的组织块沉淀。
- 在组织沉降的同时，将预先冷却的冻存盒和冻存管移入生物安全柜中。打开所有冻存管的管盖，以加快后续添加组织的速度。
- 待所有组织块沉降后，轻轻吸除多余的HBSS，仅保留沉淀上方极薄的一层液体。不建议进行离心，因为离心会导致组织块相互粘连，显著降低冻存效率。
- 使用带有宽孔的移液器吸头（用无菌剪刀剪去吸头尖端）从疏松的组织块沉淀底部缓慢吸取200 μL。将材料转移至一个冻存管中，然后继续吸取下一个，始终从沉淀底部取样。整个组织分配过程每冻存盒不得超过3–4分钟，以确保组织在冻存前仅短暂暴露于DMSO中。将组织转移至冻存管后，将冻存盒置于-80°C冰箱中至少4小时。也可选择在-80°C过夜。对剩余的冻存盒重复此操作。
- 将冻存管从冻存盒中取出，转移至冻存盒中，并置于液氮罐中进行长期保存。
2. 冻存皮层组织块的解冻与培养
材料准备
- 解冻组织样本前一天，将多聚-L-聚赖氨酸包被的培养皿/盖玻片已准备好。通常情况下，对于皮层神经元，我们使用包被的培养皿进行准备 500 μg/ mL 或 1 mg/ mL。加入足量的 poly-L-赖氨酸溶液（用硼酸盐缓冲液配制）以完全覆盖培养皿底部。若需使用玻璃盖玻片，请确保其完全浸没于聚-L-赖氨酸溶液中孵育至少12小时。使用前，用大量无菌水彻底冲洗培养皿3次，每次5分钟。
- 预热的HBSS用于清洗解冻的组织，并将组织解离成细胞悬液。所需HBSS的体积取决于待解冻组织的量，通常1个冻存管的组织用50 mL HBSS稀释，并在10 mL HBSS中进行解离。
- 含10%补铁牛犊血清（EBS）和1%抗生素/抗真菌素（AA）混合液的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM(++)）应置于 37°C 水浴锅
- 铺板培养基（NB(+++)）应在使用前新鲜配制。该培养基通过在基础培养基中添加1%抗生素/抗真菌剂以及B27和N2补充剂制备而成。
注意：培养基名称后附加的加号（+）表示在基础培养基成分中添加了添加剂。本文中，DMEM(++) 表示 DMEM 加 10% EBS 加 1% AA，而 NB(+++) 表示 NB 加 1% AA 加 B27 加 N2。
解冻与培养
- 从液氮罐中取出冻存管，并迅速在 37°C 在水浴中加热，直至观察到瓶内仅剩少量冰粒。
- 轻轻将冻存管中的内容物转移至锥形管中50 mL温热的HBSS中。使用宽口吸头轻轻吹打，以松动可能残留在冻存管中的任何组织块。将锥形管轻柔颠倒3–4次，使组织缓慢沉降至管底。组织应迅速沉淀，但如果组织块过小，则可能无法有效沉降，此时可进行短暂离心（约200 × g） g建议使用。
- 吸除多余的HBSS。
- 向组织沉淀中加入 10 mL 温热的 HBSS 并 300 μL 0.25% 胰蛋白酶 50 μL DNA酶。在 37°C 水浴5分钟，然后置于设定为80 rpm的旋转摇床中 37°C 再继续孵育 5 分钟。
- 在此孵育期结束后，将组织块转移至生物安全柜中，使用10 mL移液器轻轻搅动组织块，直至形成浑浊的细胞悬液。向细胞悬液中加入10 mL预热的DMEM(++)以终止胰蛋白酶的消化作用。
- 将解离的细胞在1200 x g 5 分钟。吸除并弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 温热的 DMEM(++) 中，使用血细胞计数板对细胞数量进行定量。
- 将细胞接种于多聚-L-赖氨酸包被的培养皿。通常，一个60 mm培养皿接种1×10⁶个细胞6 细胞
- 让细胞在组织培养孵育箱中贴附于培养皿/盖玻片约1小时。建议每隔10分钟在一块培养板中观察一次贴壁情况，直至观察到有效贴附。随后，轻柔地将培养基更换为新鲜的DMEM(++)。
- 24小时后，将DMEM(++)更换为温热的NB(+++)。每隔5天用新鲜NB(+++)进行半量换液（50%）。健康的培养物通常在24小时后即可见分化及突起生长的迹象。在这些条件下，每隔4-5天进行半量换液，培养物可长期维持，最长可达4-6周。
- 用于生成神经前体细胞（NPCs）时，采用类似方案，区别在于离心后使用不含EBS的DMEM。细胞接种于T-25培养瓶中，培养基为DMEM/F12（1:3）并添加B27和EGF（20 ng/mL），以促进神经球的形成。为诱导NPCs分化，将神经球接种于经层粘连蛋白（10 μg/mL）包被的盖玻片上，培养基为添加N2的DMEM/F12（1:3）。
3. 代表性结果
健康的培养物在解冻后5天会显示出明显的生长和分化，并通常在10天左右生长趋于稳定（图1）。免疫细胞化学染色显示，人和大鼠原代神经元培养物中均存在大量星形胶质细胞（图2A）和神经元（图2B）。本方案也适用于生成悬浮生长的神经前体细胞（NPC）神经球（图3A），在诱导分化条件下可获得高质量的混合培养物（图3B,C）。
图1. 冻存人脑皮层组织的细胞培养。 将冻存的人脑皮层组织块解冻后接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，并培养10天。至第5天可见细胞开始扩展，至第10天达到汇合状态。比例尺：100 μm。
图 2. 细胞培养物的免疫细胞化学染色。 （A）使用胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP，粗箭头）对培养物进行染色。（B）使用神经元标志物β-微管蛋白III（TIII，细箭头）检测神经元。（C）人和大鼠的培养物在培养10天后均显示出丰富的胶质细胞和神经元。一抗：小鼠抗GFAP（1:1000）和兔抗TIII（1:1000）。二抗：抗小鼠Alexa 594（1:500）和抗兔Alexa 488（1:500）。细胞核染色：Hoechst 蓝（1:1000）。比例尺：50 μm。
图3. 神经球的生成。 （A）冷冻组织按上述方法处理后，培养生成神经球。（B）将神经球接种于玻璃盖玻片上，在诱导分化条件下培养10天，可见细胞从神经球向外迁移。（C）在分化中神经球的扩展边缘区域，可见神经元和星形胶质细胞。细胞核复染、一抗和二抗的使用同图2。
讨论
冷冻保存为珍贵的脑组织样本提供了未来使用的保藏机会。本文介绍一种简单而有效的方案，可从冷冻的脑组织块中分离培养富含神经元的细胞培养物以及神经前体细胞。该方法经济实惠，避免了传统冷冻保存技术中使用昂贵的程序降温仪所带来的成本。本方案通过快速且有效的组织块冷冻方式，可在解冻后获得具有活性的神经元培养物。整个冷冻过程最短仅需20分钟。除原代神经元培养外，使用该方法还可将组织块解冻后用于培养悬浮生长的神经球形式的神经前体细胞（NPCs）。值得注意的是，本冷冻体系中不含血清，可确保细胞保持未分化状态。在诱导分化条件下，由冷冻组织产生的神经球在扩增能力和分化率方面均与新鲜组织来源的神经球极为相似。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究得到了加州大学尔湾分校本科生研究机会项目（A.R. 和 S.P.）的资助，以及加州阿尔茨海默病倡议项目、美国国立卫生研究院资助号 HD38466 和阿尔茨海默病研究中心资助号 AG16573（J.B.）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基（DMEM） | Invitrogen | 11995-073 | 高葡萄糖 1X |
| 添加牛犊血清 | Hyclone | SH30072.03 | 用于培养基 |
| Neurobasal-A 培养基（1X），液体 | Invitrogen | 1088-022 | |
| B27 添加剂 | Invitrogen | 17504-044 | Neurobasal 培养基的添加剂 |
| N2 添加剂 | Invitrogen | 17502-048 | Neurobasal 培养基的添加剂 |
| 胰蛋白酶（10X） | Cellgro | 25-054CI | 组织解离 |
| 牛胰脱氧核糖核酸酶 1（DNase） | Sigma-Aldrich | D4527-30KU | 组织解离 |
| Hanks 平衡盐溶液（HBSS）（10X） | GIBCO, by Life Technologies | 14065 | 组织清洗、洗涤及冷冻保存液 |
| 聚-L-赖氨酸- 500mg | Invitrogen | P2636 | 神经元细胞黏附底物 |
| 抗生素-抗真菌素（100X），液体 | Invitrogen | 15240-062 | 防止污染 |
| 大孔移液器吸头（1-200 µl） | Fisher Scientific | 02-681-141 | 防止细胞受到剪切应力 |
| 刻度移液器吸头（101-1000 µl） | USA Scientific, Inc. | 1111-2721 | |
| 21 G1 精密导向针头 | BD Biosciences | 305165 | 用于清洗组织 |
| 10 ml 移液管 | USA Scientific, Inc. | 1071-0810 | 单独包装 |
| 50 ml 离心管 | USA Scientific, Inc. | 926-9-04 | |
| 单刃剃须刀片 | Smith & Nephew Inc. | 67-0238 | 用于切碎组织 |
| 60 x 15 mm 聚苯乙烯培养皿 | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | 用于常规培养 |
| 100 x 15 mm 聚苯乙烯培养皿 | USA Scientific, Inc. | 8609-0010 | 用于清洗组织 |
| 冷冻储存盒 | Nalge Nunc international | 5026-1010 | |
| 冷冻容器 | Nalge Nunc international | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
| 2.0 ml 冷冻小瓶 | Nalge Nunc international | 5012-0020 | |
| DMSO | Fisher Scientific | D128-500 | 用于冷冻保存液 |
| 无水乙醇（200 proof） | Sigma-Aldrich | E7023 | 用于消毒刀片 |
参考文献
- Robbins, R. J. Cryopreservation of human brain tissue. Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).
- Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. Controlled-rate freezing of human ES cells. Biotechniques. 38, 879-880 (2005).
- Paynter, S. J. Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells. Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).
- Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium. J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).
重印与许可
