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1。皮层组织块冷冻保存
材料的制备
- 准备无菌水（1:9）的10倍原液稀释1X汉克的缓冲盐溶液（HBSS）。在摄氏4度商店的HBSS。
- 准备10％DMSO冻存液稀释的HBSS（1:9）的二甲基亚砜。冻结介质应该是取得了新的冷冻保存前直到冷冻储存在摄氏4度。
- 钢刀片是用于组织系统斩波。在使用之前，刀片被淹没在70％乙醇为2小时消毒。立即组织处理前，无菌水冲洗3次刀片。避免留在无菌水的剃须刀过多的时间，因为它很容易氧化。
- 一个NALGENE冷冻集装箱装入离心管（2.5毫升），然后带进无菌生物柜。 1毫升的冰鲜冷冻介质添加到每一瓶。冷冻集装箱，然后放置在摄氏4度至少2小时。
清洗，切菜，和冻结
- 被冻结的脑组织，脑膜膜和血管的清洁。使用无菌针尖小心地取下冰袋上工作时从组织的碎片。清理组织应轻轻冲洗与冷的HBSS，并转移到一个新的Petri砍菜。
- 冰袋上工作，使用消毒的刀片，迅速 组织切成约1毫米的3块。清理组织工作的一小部分，在更好地控制在切菜过程中的时间结果，产生更均匀的块大小。
- 在50 mL锥形管，慢慢地加入到50毫升的HBSS切碎组织。轻轻冲洗培养皿与HBSS中，以收集任何剩余的组织块。允许组织块下降到试管底部，建立一个松散的组织块颗粒。
- 虽然该组织是解决生物安全柜，把先前冷冻的冷冻集装箱和冷冻管。摘帽所有的离心管，以加速加入组织的过程中。
- 所有的组织块纷纷落户后，轻轻吸出多余的HBSS的，留下一个非常薄的层以上的颗粒的介质。离心气馁，因为它会导致组织块要坚持对方，冻结效率显着减少。
- 使用广泛窍（切割用无菌剪刀尖）的枪头，慢慢地从底部的松散组织块颗粒收集200微升。的材料转移到一个离心管，从底部的沉淀下，再次收集组织。重要的是整个组织分配过程不超过3-4分钟每冷冻集装箱。这将确保该组织是暴露只是一个时间的冻结前的短期内，以二甲基亚砜。组织转移到小瓶后，放置至少4小时，在A - 80℃冷冻的冷冻集装箱。另外，冷冻集装箱可以在一夜之间，在-80℃。重复这个过程中，任何剩余的冷冻集装箱。
- 从冷冻集装箱的冷冻管（S）转移到一个cryobox和长期储存在液氮罐。
2。解冻和冷冻皮层组织块的培养
材料的制备
- 一天前解冻的组织样本，聚- L -赖氨酸涂布培养皿/盖玻片准备。皮层神经元在一般情况下，我们准备用500微克/毫升或1毫克/毫升涂菜肴。加入足够的聚- L -赖氨酸溶液（硼酸盐缓冲液中），全面覆盖的菜底部。如果需要盖玻片，确保它们完全淹没下聚- L -赖氨酸的解决方案。孵育至少12小时。在使用之前，彻底的菜肴与自由主义的无菌水冲洗3次，每次5 min。
- 暖的HBSS是用来清洁解冻组织以及组织分解成细胞悬液。取决于解冻组织的需要的HBSS数量会有所不同，但通常为1离心管会稀释在50毫升的HBSS，并将于10毫升的HBSS分离。
- 贝科的改良Eagle中等10％的铁补充牛小牛血清（EBS）和1％的抗生素/ antimycotic（AA）的混合物（DMEM培养液(++))应放置在37℃水浴。
- 电镀液（注(+++))应在使用前新鲜。这种介质是准备加入抗生素/ antimycotic加1％B27和N2补充剂。
注:媒体名称与穿越（+）追加指示列入媒体的碱基组成的添加剂。在这个文本中，DMEM培养液（+）表示DMEM培养液加10％EBS的加1％，AA，而NB (+++)表示注:PL我们的1％AA加B27的加氮气。
解冻和培养
- 从液氮罐取出离心管，并迅速解冻在37 ° C直到水浴中只有一小冰粒是观察里面的小瓶内容。
- 轻轻转移的内容，以温暖的HBSS 50毫升的小瓶，在一个锥形管。使用宽口尖轻轻驱逐任何剩余的组织块的离心管中卡住。反转管的3-4倍，并允许组织在底部慢慢收集。组织应该迅速解决，但如果块太小，这可能不会发生光离心（〜200 ×克）建议。
- 吸干多余的HBSS。
- 添加10毫升温暖的HBSS组织颗粒和300μL0.25％胰蛋白酶和50μLDNAase。在37℃水浴孵育5分钟，然后在轨道摇床设置为80 rpm和37 ° C的一个额外的5分钟。
- 这一时期后，将进入生物安全柜的组织块，并用10 mL的吸管仔细搅动的组织块，直到形成阴天细胞悬液。停用温暖的DMEM培养液中添加10毫升的胰蛋白酶（+）的细胞悬液。
- 1200 × 克 5分钟离心分离细胞。吸弃上清，在10毫升的温暖的DMEM重悬细胞沉淀（+ +）和量化使用血球细胞数。
- 聚- L -赖氨酸涂层菜肴板细胞。通常，一个60毫米的菜将被镀与1 × 10 6细胞。
- 允许细胞组织培养箱培养约1小时的菜/盖玻片的重视。建议在一个板块监测的附件的进展，每10分钟，直到有效附件。然后，轻轻地更换新鲜的DMEM (++).中期
- 24小时后，更换的DMEM（+）用温水注(+++).部分介质的变化（50％）进行每5天用新鲜的NB (+++).健康的文化通常24小时后，进程的分化和增长的迹象。文化在这些条件下，执行部分介质的变化，每4-5天，可维持长时间的时间可达4-6周。
- 对于生成的神经前体细胞（筹备），类似的协议，离心后，没有EBS的DMEM培养液的异常。细胞是镀金的T - 25的DMEM/F12（1:3），B27与表皮生长因子（20毫微克/毫升）的补充，让neuropheres形成烧瓶。要区分的NPC，神经球镀金层粘连蛋白（10微克/毫升）的DMEM/F12（1:3）培养基用N2涂盖玻片。
3。代表性的成果
健康的文化会表现出显着的生长和分化，后5天，解冻后，通常会在其增长稳定10天（图1）。这些文化Immuncocytochemical染色揭示众多的星形胶质细胞（图2A）和神经元对人类和大鼠原代神经元的文化（图2B）。此协议也适合对NPC的一代自由浮动的神经球（图3A），区分条件下，高品质（图3B，C）的混合培养的结果。
图1。冷冻人脑皮层组织细胞培养 ，冷冻的人脑皮层组织块接种于多聚赖氨酸涂布盖玻片解冻，生长10天。白天5细胞扩张明显，达到10天汇合。比例尺:100微米。
图2。细胞培养免疫细胞化学染色（A）培养染色标记的胶质神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP，厚箭头）。 （二）发现神经元与神经元的标记β-微管蛋白III（TIII，细箭头）。 （三）人类和鼠文化展示丰富的神经胶质细胞和神经元后的10天中文化。一抗:鼠抗GFAP（1:1000）和兔抗TIII（1:1000）。二抗:抗鼠Alexa的594（1:500）和抗兔Alexa的488（1:500）。核染色:Hoestch蓝色（1:1000）。比例尺:50微米。
图3。代神经球。（一）冰冻组织处理，如上所述，并允许传播神经球。 （二）神经球被镀上盖玻片与众不同的条件下生长10天，导致细胞从神经球迁移。 （三）这两种神经元和星形胶质细胞是目前在区分神经干扩大边缘。核counterstaining，如在图2中使用的小学和中学的抗体。