取向排列的静电纺丝纤维可引导神经元在体外的生长，是神经再生支架的潜在组成部分。本文描述了一种制备静电纺丝纤维基底以及在无血清条件下培养原代大鼠E15感觉（DRG）和运动神经元的方法。还包括通过免疫细胞化学对神经元进行可视化观察的技术。
本文内容
摘要
摘要
静电纺丝是一种用于制备微米至纳米级纤维的技术。通过该技术可制备出不同取向程度的纤维，从高度取向到完全无规排列均可实现。此外，纤维可由多种材料纺丝而成，包括可生物降解的聚合物，如聚-L-乳酸（PLLA）。这些特性使静电纺丝纤维适用于组织工程中的多种支架应用。我们的研究重点是利用取向性静电纺丝纤维促进神经再生。我们先前已证实，取向性静电纺丝PLLA纤维能够引导初级感觉神经元和运动神经元的轴突向外生长。 体外我们坚持认为，在评估用于模拟真实神经元的生物材料时，使用原代细胞培养系统至关重要 体内 尽可能接近原样。本文描述了我们实验室用于电纺纤维支架以及在电纺支架上培养背根神经节外植体、分离的感觉神经元和运动神经元的技术。然而，本文所述的电纺丝和/或培养技术可轻松调整用于其他应用。
方案
1. 聚-L-乳酸（PLLA）纺丝溶液
- 将 0.4 g PLLA 溶于 9 mL 氯仿中，低热搅拌溶解。
- 向溶液中加入 1 mL 二甲基甲酰胺，使溶液终浓度为 4% PLLA (w/v)，溶剂为氯仿:DMF 9:1 (v/v)。
- 将该溶液装入带有钝头 23 号金属针头的聚丙烯或玻璃注射器中。
2. 旋转基底的制备1
- 通过在低温加热下搅拌，配制8% (w/v) 的85:15 PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）氯仿溶液。
- 将洁净的玻璃盖玻片用PLGA溶液覆盖表面，使盖玻片表面均匀涂布PLGA。静置使PLGA干燥成薄膜（约30分钟）。
3. 静电纺丝2
- 使用导电碳胶带将PLGA包被的玻璃盖玻片固定在收集器上。对于取向纤维，收集器为电机驱动的转轮；对于随机分布纤维，收集器为静止平板。
- 将注射器放入泵中，针尖距收集转轮20 cm。将泵速设定为约2 mL/hr；若使用转轮，将电机转速设为300–400 RPM。如条件允许，对收集器施加-2 kV直流偏压，对金属针尖施加+15 kV电压。若无法获得双极电源，则将收集器接地。
- 纤维将从注射器针尖喷射并收集在旋转转轮上。持续旋转直至获得所需纤维密度。定期使用固定在非导电棒上的纸巾擦拭金属针尖，以防止针尖堵塞。
4. 护城河法1
- 离心后，用移液枪将PLGA沿盖玻片边缘滴加一圈，对电纺样品进行“护城河”处理。待PLGA干燥，以在培养过程中维持纤维的取向排列。
5. 蛋白质包被
- 静电纺丝纤维和玻璃对照需在细胞培养前进行蛋白包被。将基质材料浸入蛋白溶液中至少一小时，随后吸除多余溶液，并持续吸净直至基质完全干燥。可选的蛋白溶液包括：PLL（聚-L-赖氨酸）L-赖氨酸) (100 µg/ mL），层粘连蛋白（laminin）25 µg/ mL）或纤连蛋白（50 µg/ mL)。如果使用PLL，则在初次包被后，应将基质用无菌水冲洗并重复干燥两次。
6. 获取 E15 大鼠胚胎3
*所有实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》进行，并经密歇根大学实验动物使用与护理委员会批准。
- 准备：检查动物是否怀孕。解冻 3 mL 胰蛋白酶和 3 mL 胎牛血清，预热一瓶 L15 培养基。将巴斯德吸管进行火焰抛光。所有手术器械用 70% 乙醇消毒 30 分钟。
- 配制并预热铺板培养基（见表 1）。
- 安乐死：腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪。等待 10–15 分钟，检查角膜反射和足底回缩反射是否消失。确认反射消失后，进行颅内注射戊巴比妥钠（FatalPlus）。
- 提起腹部皮肤，切开皮肤和肌肉层以暴露腹腔。找到子宫，并在宫颈和卵巢处将其分离。
- 用剪刀将胚胎从子宫中取出，并立即放入预热的 L15 培养基中。（以下所有操作均在解剖显微镜下进行，胚胎及解剖所得脊髓组织应始终浸没于预热的 L15 培养基中。）用镊子夹住下颌及枕骨下方，剪除胚胎头部。
7. 解剖3
- 将胚胎置于一侧。用一把镊子保护脊髓，同时用另一把镊子去除四肢和腹部器官。
- 翻转胚胎并用一把镊子固定。从颈部到尾部沿胚胎全长剪开，直至整个脊髓完全暴露。
- 小心夹住脊髓末端，将其向尾部方向翻卷拉出。脊髓将连同膜和背根神经节（DRG）一并被完整剥离。
- 若需进行背根神经节外植体培养或分离感觉神经元培养，请将背根神经节从脊髓上剪下，并转移至盛有温热L15培养液的新培养皿中。
- 如进行背根神经节外植体培养，请跳至步骤10.2
- 如进行分离感觉神经元培养，请跳至步骤9
- 如进行运动神经元培养，背根神经节将在步骤7.5中随膜一并去除
- 从脊髓顶端夹住膜，像脱长筒袜一样向下剥离，从而去除脊髓表面的膜。对所有胚胎重复此操作，随后将脊髓切成小段（2–3 mm）。
8. 运动神经元（MN）处理5,6,7
- 将切碎的脐带组织和 L15 培养基倒入锥形管中，以 1000 RPM 离心 2–3 分钟，使组织沉淀。
- 弃去上清液，向沉淀的组织中加入 3 mL 胰蛋白酶，于 37°C 水浴中孵育 20 分钟。
- 加入 3 mL 胎牛血清（FBS）至锥形管中，以 1000 RPM 离心 2–3 分钟，重新沉淀组织。
- 弃去上清液，用 FBS 涂覆一支火焰抛光的巴斯德吸管。
- 向锥形管中加入一整管 L15 培养基，然后轻轻吹打，直至溶液均匀且无可见团块。避免产生气泡。
- 在 L15 培养基中配制 9% 的 Optiprep 溶液。每两个胚胎准备一管含 3 mL Optiprep 溶液的离心管（若胚胎数量为奇数，则向上取整）。
- 将均质化后的溶液缓慢滴加至 Optiprep 溶液上层，均匀分配至所有离心管中。以 2000 RPM 离心 15 分钟。
- 小心吸取每管上层 2 mL 液体，收集至一个 50 mL 锥形管中。用 L15 培养基补满锥形管，以 1000 RPM 离心 5 分钟，以清洗细胞中的 Optiprep。
- 弃去上清液，将细胞重悬于少量铺板培养基中（250–500 µL）。使用台盼蓝排斥法计数活细胞。跳至步骤 10.1
9. 感觉神经元（SN）处理7
- 将从脊髓和 L15 中取出的背根神经节（DRG）放入锥形管中，以 1000 RPM 离心 2–3 分钟，使组织沉淀。
- 弃去上清液，向沉淀的 DRG 中加入 3 mL 胰蛋白酶，于 37°C 水浴中孵育 10 分钟。
- 向锥形管中加入 3 mL 胎牛血清（FBS），以 1000 RPM 离心 2–3 分钟，重新沉淀组织。
- 弃去上清液，并用 FBS 涂覆火焰抛光的巴斯德吸管。
- 向锥形管中加入一整管 L15 培养基，轻轻吹打至溶液均匀，无可见团块。避免产生气泡。
- 将匀浆液以 1000 RPM 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于少量 SN 铺板培养基中（250–500 µl）。使用台盼蓝排斥法计数活细胞。继续进行步骤 10.1
10. 铺板与培养
- 用于解离的 SN 或 MN 培养：
- 用少量培养基润湿基质表面，然后加入适量的细胞悬液。解离后的细胞应以较低密度接种（25–50 个细胞/mm2）。加入细胞后至少静置 1 小时，使细胞充分贴壁，再向孔中加满培养基。
- 用于 DRG 外植体培养：
- 用少量培养基润湿基质表面，然后将 DRG 加入培养基中。将 DRG 均匀分布在基质表面（约 4 个 DRG 可放置于 22×22 mm 的盖玻片上）。加入 DRG 后至少静置 4 小时，使其充分贴壁，再向孔中加满培养基。
- 培养物可在不更换培养基的情况下维持长达 4 天。若需更长时间培养，应使用饲养培养基进行半量换液。饲养培养基的成分与接种培养基相同，但不含 L-谷氨酰胺。
11. 免疫细胞化学1,5,8
- 细胞固定：吸除培养基，加入温热的4% PFA（多聚甲醛），孵育30分钟。随后用1× PBS洗涤3次，每次5分钟。
- 封闭与通透：配制封闭/通透液（含1.25%牛血清白蛋白、0.05% Triton X-100和2.0%正常山羊血清的1× PBS溶液）。吸除PBS，加入封闭/通透液，室温孵育30分钟。随后用1× PBS洗涤1次，每次5分钟。
- 一抗孵育：配制一抗工作液（含10%正常山羊血清、1.25%牛血清白蛋白、0.1%叠氮化钠、0.05% Triton X-100，用1× PBS定容至10 mL）。加入适量的一抗（参见表2）。在若干培养皿中铺上Parafilm膜，每种基质对应在膜上滴加200 µl一抗工作液。将基质倒置，使细胞面朝下漂浮于一抗工作液上，4°C孵育过夜（若环境为空调或特别干燥，可在培养皿角落加入一片吸有水的滤纸以防止工作液蒸发）。
- 二抗孵育：从一抗中取出基质（工作液可回收，4°C保存后重复使用），用1× PBS洗涤2次，每次5分钟。将200 µl用PBS按1:200稀释的二抗滴加在铺有Parafilm膜的培养皿上，倒置基质使其漂浮于二抗液滴上，室温避光孵育4小时。
- 二抗孵育后，取出基质并用1× PBS洗涤2次，每次5分钟。将基质用含DAPI或其他合适核复染剂的Prolong Gold封片剂封固于载玻片上。
12. 代表性结果：
图1展示了取向排列和随机分布的电纺纤维的典型形貌。我们通常获得的微针纯度为 >90% 神经元7,8 采用本方案，我们已将背根神经节（DRG）培养物维持长达一周，期间未见明显的成纤维细胞生长。图2显示了培养24小时后，在玻璃和纤维表面典型的运动神经元形态，以及免疫荧光染色结果。图3展示了在玻璃和纤维上培养三天后经免疫荧光染色的背根神经节（DRG）培养物。
图1. 通过选择不同的收集器来调控纤维的取向排列。A）在旋转轮式收集器上制备的取向排列纤维；B）在静止平板收集器上制备的随机分布纤维。标尺 = 20 μm。
图2. 在PLL包被的A）纤维和B）玻璃上培养24小时后，标记TuJ1（绿色）和DAPI（蓝色）的代表性运动神经元。比例尺 = 20 μm。
图3. 背根神经节在聚赖氨酸包被的 A）玻璃和 B）纤维上培养3天后，经神经丝蛋白（绿色）染色的代表性图像。比例尺 = 200 μm。
| 储存液： | MN 培养基： | DRG/SN 培养基： |
| 10 mg mL-1 白蛋白 | 12.5 μl | -- |
| 10 mg mL-1 酒精转铁蛋白 | 50 μl | 40 μl |
| 50 μg mL-1 β-雌二醇 | 2.7 μl | 2.2 μl |
| 0.1 mg mL-1 生物素 | 50 μl | -- |
| 16 mg mL-1 过氧化氢酶 | 8 μl | -- |
| 15 mg mL-1 D-半乳糖 | 50 μl | -- |
| 50 μg mL-1 氢化可的松 | 3.7 μl | 2.9 μl |
| 0.63 mg mL-1 孕酮 | 0.5 μl | -- |
| 16 mg mL-1 腐胺 | 50 μl | -- |
| 50 μg mL-1 硒 | 3.4 μl | 4.1 μl |
| 2.5 mg mL-1 超氧化物歧化酶 | 50 μl | -- |
| * 500 ng mL-1 神经生长因子 | -- | 1 mL |
| * 100X PSN | 0.5 mL | 0.5 mL |
| * B27 | 1 mL | 1 mL |
| * 2 mM L-谷氨酰胺 | 35 μl | 35 μl |
| * Neurobasal | 加至 50 mL | 加至 50 mL |
表1. 在使用前立即向培养基中添加带星号（*）的组分。其余组分可配制成储存液，于-20°C保存，直至使用时取出6,7。
| 一抗（浓度） | 神经元： | 胶质细胞： | 成纤维细胞： |
| anti-β-tubulin (TuJ1) (1:1000) | ✓ | X | X |
| anti-neurofilament (1:1000) | ✓ | X | X |
| anti-S-100 (1:250) | X | ✓ | ✓ |
| anti-NGFR p75 (1:500) | ✓ | ✓ | X |
表2. 一抗的选择取决于研究者的研究目的。以上是我们实验室成功使用过的几种抗体及其浓度。S-100 特别适用于鉴定施万细胞和/或检测是否存在成纤维细胞污染，但需注意，必须与 NGFR p75 联合使用才能区分胶质细胞与成纤维细胞4。我们还注意到，NGFR p75 对神经突的染色较弱，而若目标是观察单个神经突，则神经丝蛋白或 TuJ1 是更佳的选择。
讨论
本方案包含若干关键步骤。第一步是正确制备静电纺丝纤维基质。在液体培养基中，PLLA纤维、PLGA薄膜和PLGA护城河将作为一个整体从玻璃盖玻片上分离。如果省略PLGA，则PLLA纤维无法保持平整的片状结构，而是会卷曲成无法使用的缠结状态。因此，加入PLGA薄膜作为合适的基底，以在培养过程中维持纤维的排列。护城河结构在纺丝完成后添加，其作用一是确保纤维牢固地固定在PLGA薄膜上，二是增强薄膜的结构刚性。此外，在固定、染色和封片等操作过程中，护城河还可作为便于操作的抓手。第二步关键操作是吹打（trituration）。应尽一切努力避免气泡的产生。此外，我们发现使用火焰抛光过的移液管进行此步骤可显著提高收获率。进行火焰抛光时，点燃本生灯，并在移液管上连接一个橡皮球。将移液管尖端快速通过火焰2至3次，同时持续挤压并释放橡皮球——气流通过移液管可防止尖端完全闭合。使用前应检查移液管尖端，确保孔洞仍处于开放状态且边缘略呈圆润状。
静电纺丝是一种高度通用的工艺；通过调整静电纺丝参数，可制备出具有多种形貌的纤维。Tan et al. (2005) 详细报道了影响聚-L-乳酸（PLLA）静电纺丝纤维直径的参数的系统性研究。Wang et al. (2009) 则对影响静电纺丝 PLLA 纤维取向排列的参数进行了深入研究。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
NIH K08 EB003996
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PLLA | Boehringer Ingeheim | Resomer L210 | |
| PLGA 85:15 | Sigma-Aldrich | 43471 | |
| L15 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 11415 | |
| 白蛋白 | Sigma-Aldrich | A2289 | |
| 脱铁转铁蛋白 | Akorn Inc | AK8227 | |
| 生物素 | Fisher Scientific | AC 23009-0010 | |
| 半乳糖 | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| 孕酮 | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| 腐胺 | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| 硒 | Sigma-Aldrich | S9133 | |
| β-雌二醇 | Sigma-Aldrich | E 1132 | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H0396 | |
| 过氧化氢酶 | Sigma-Aldrich | C40 | |
| 超氧化物歧化酶 | Sigma-Aldrich | S4636 | |
| Neurobasal 培养基 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 21103-049 | |
| PSN | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 15640 | |
| L-谷氨酰胺 | Nalge Nunc International | 1680149 | |
| 胰蛋白酶 | Nalge Nunc International | 1689149 | |
| 胎牛血清 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 26140 | |
| Optiprep | Accurate Chemical & Scientific Corporation | 2011 | |
| PLL | Sigma-Aldrich | P4832 | |
| 纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F 4759 | |
| 层粘连蛋白 | Invitrogen | 23017-015 | |
| B27 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 17504-044 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 抗-TuJ1 抗体 | BD Biosciences | 556321 | |
| 抗神经丝蛋白抗体 | EMD Millipore | AB1987 | |
| 抗 S100 抗体 | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| 抗 NGFR p75 抗体 | Sigma-Aldrich | N3908 | |
| 正常山羊血清 | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| 导电胶带 | Ted Pella, Inc. | 13073-1 | |
| Prolong Gold +DAPI | Invitrogen | P36931 |
参考文献
- Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons. Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).
- Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications. Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Chapter 19 (1998).
- Kameda, Y. Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland. Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).
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- Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death. Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).
- Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal. J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).
- Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers. Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).
- Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
- Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications. J. Neural Eng. 6, (2009).
重印与许可
