从原核培养物中简化质粒DNA纯化流程

摘要

本方案为从大肠杆菌（E. coli）培养物中高效并行进行裂解液澄清和质粒DNA纯化提供了一种经济有效的替代方法。AcroPrep Advance工艺首先采用优化的裂解液澄清滤板，随后在高结合容量的DNA结合滤板上进行纯化。

摘要

我们介绍了使用AcroPrep Advance滤板进行96孔质粒制备的完整流程，从原核生物培养开始，直至获得高纯度DNA。该方法基于多孔过滤技术，用于清除细菌裂解液并纯化DNA，从而实现质粒制备的高效流程化。含有硅基介质的滤板可通过真空过滤或离心方式轻松处理，获得较大量的质粒DNA。定量分析表明，纯化的质粒DNA质量稳定，平均OD_260/280比值为1.97。总体而言，该方法获得的质粒产量更高、纯度更好，适用于测序、克隆等下游应用。使用AcroPrep Advance滤板的这一简化方法，可实现手动、半自动或全自动操作。

方案

1. 裂解液澄清

1. 在含有适当抗生素的LB培养基中，于37 °C、摇床条件下，过夜培养接种了目标质粒DNA的E. coli菌液（每孔1 mL），培养于深孔板中。
2. 在5,000 × g条件下离心培养板中的E. coli 10分钟，弃上清液。
3. 用100 μL重悬缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，10 mM EDTA，100 μg/mL RNase A）重悬每个菌体沉淀。
4. 每孔加入100 μL裂解缓冲液（200 mM NaOH，1% SDS），使用板式摇床震荡2分钟。
5. 每孔加入100 μL中和缓冲液（3.0 M醋酸钾，pH 5.5），震荡2分钟。
6. 将细胞裂解液转移至裂解液澄清板中。
7. 将DNA结合板置于350 μL收集板上方，并放入真空装置底部。组装真空装置（见图1）。
8. 将裂解液澄清板置于真空装置上方。
9. 在10 in. Hg（0.34 bar）真空度下抽滤，使滤液收集至DNA结合板中。切勿使用超过12 in. Hg（0.41 bar）的真空度。
10. 拆卸真空装置，将2 mL废液收集板置于装置底部。

2. DNA 结合

1. 将DNA结合板移至多孔过滤装置顶部（见图2）。
2. 每孔加入300 μL结合缓冲液（6 M 盐酸胍），用移液器吹打混匀。
3. 施加真空（慢速抽滤时约为5 in. Hg（0.17 bar）），弃去滤液。此时DNA已结合至膜上。
4. 用洗涤缓冲液（80%乙醇）每孔400 μL进行洗涤。
5. 施加真空，然后弃去滤液。若使用2 mL收集板或将滤液直接抽入废液瓶，可丢弃收集板。
6. 重复洗涤一次。
7. 将滤板底部在吸水纸上轻压以干燥。
8. 再次施加真空5–10分钟，确保去除残留乙醇。
9. 再次轻压滤板底部，确保去除乙醇液滴。

3. DNA 洗脱

1. 每孔加入 70 μL 洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM EDTA）。若需要更高的 DNA 浓度，可将体积减少至 50 μL/孔，但平均总得率会降低。
2. 在室温下孵育平板 1 分钟。
3. 可通过真空抽滤或离心法洗脱纯化的 DNA。
4. 真空法：将洁净的收集板（无 DNase、RNase）放入真空装置中。将滤膜板置于真空装置上方，以 15 in. Hg（0.5 bar）的真空压力抽滤 1 分钟，直至所有洗脱缓冲液完全通过 DNA 结合板。收集纯化的 DNA（见图 3）。
5. 离心法：将纯化滤膜板置于洁净的收集板上，以 1,000 × g 离心 5 分钟。

4. 定量与定性分析

1. 测定OD_260/280，计算纯化DNA的浓度。
2. 对纯化的质粒DNA进行琼脂糖凝胶分析。

5. 典型结果

采用传统离心法和 Pall AcroPrep Advance 裂解液澄清滤板对 E. coli 裂解液进行澄清后，起始材料中的碎片明显减少（图 4）。

将三种浓度的质粒DNA加入TE缓冲液中，并通过AcroPrep Advance裂解液澄清过滤板。过滤前后质粒DNA浓度的比较显示，在三种浓度下回收率均约为100%（图5）。

为证明从澄清的 E. coli 裂解液中回收 DNA 的效果，将质粒 DNA 加入粗裂解液中，随后通过过滤进行澄清；另将相同质粒 DNA 加入过滤后的细胞裂解液中作为对照。对各样品取等分试样进行电泳分析（图6）。各样品均显示出单一且强度相近的清晰条带，表明在基于过滤的澄清步骤中几乎未发生 DNA 损失。

使用 Pall 的 350 μL 和 1 mL DNA 结合滤板，以及另外两个品牌的 350 μL DNA 结合板，从含有 pCAT 质粒 DNA 的 E. coli 裂解液中纯化 E. coli 培养物。所有纯化步骤均按照制造商推荐的方案进行。其中，Pall 的 1 mL AcroPrep Advance DNA 纯化滤板获得了最高的 DNA 浓度和总得率（图 7 和表 2）。

尽管竞争者 W 的 DNA 浓度较高（155 ng/μL），但由于回收体积较低（约 30 μL），其总 DNA 产量最低，为 4.7 μg/孔。竞争者 M 的 DNA 浓度最低，为 108 ng/μL，总产量为 5.6 μg/孔。

图8显示了从三种不同DNA结合板纯化的pCAT DNA的琼脂糖凝胶分析结果。在电泳前，将每个收集到的样品体积调整至65 μL，以校正回收体积的差异。所有样品均显示出超螺旋质粒DNA，但每种滤膜板的DNA得率有所不同。

图9显示，制备的DNA均为超螺旋构型，且浓度相似。

图1. 裂解液澄清用真空抽滤装置的组装。

图 2. DNA 结合用真空抽滤装置的组装。

图3. 用于真空洗脱的真空 manifold 组装。

图4. 过滤简化了样品澄清过程。使用真空过滤（350 μL AcroPrep Advance 裂解液澄清过滤板）或传统离心法对300 μL粗裂解液进行澄清处理，每组三个重复样品。在澄清前后测定OD₃₂₀。

图 5. pDNA 经 AcroPrep Advance 裂解液澄清滤板过滤后的完全回收。300 μL TE 缓冲液中添加 pCAT 至浓度为 25、50 和 100 μg/mL。根据过滤前后 OD₂₆₀ 测定 DNA 浓度并计算回收率，N = 2。

图6. 澄清后pCAT DNA的回收。在澄清前或澄清后向裂解液中加入等量pUC19，随后用TE缓冲液按1:10稀释。每孔上样2 μL，电泳于1.2%琼脂糖凝胶。

图7. 使用Pall Acroprep Advance DNA结合滤板比竞争对手滤板每孔获得更高的质粒DNA产量。 使用指定的DNA纯化板从DH5α菌株的1 mL（Pall和竞争对手M）或1.5 mL（竞争对手W）过夜培养物中提取pCAT质粒DNA（OD₂₆₀）。纯化操作按照各滤板制造商推荐的方案进行。误差线表示标准误差（n > 6）。

图8. 在指定DNA结合板上纯化的pCAT DNA的琼脂糖凝胶分析。对纯化的质粒DNA进行1.2%琼脂糖凝胶电泳。样品来自三次独立纯化后的合并样本，纯化后洗脱液体积调整至65 μL，稀释1:10。每泳道上样2 μL。

图9. 采用离心法或真空法进行最终洗脱液收集时，纯化DNA的质量与回收率相似：纯化pDNA的琼脂糖凝胶电泳结果。pDNA纯化按照AcroPrep Advance滤板制造商推荐的方案进行。洗脱步骤采用离心法（1,000 × g离心5分钟）或真空法（15 in. Hg（0.5 bar）下抽真空2分钟）。

讨论

我们介绍一种简便且高效的 AcroPrep Advance 滤板操作流程，该方法具有多项优势。该方法在手动、半自动或全自动 AcroPrep Advance 操作模式下均能实现质粒 DNA 的最大得率。裂解液澄清板上集成的预滤膜可对样品进行稳定过滤，即使样品中含有较高含量的颗粒物亦能有效处理。板孔的几何结构使整块板的过滤速度更快、更均匀，且滞留体积最小；出口尖端的几何设计可使样品直接流入接收板，无需担心交叉污染。尤为重要的是，AcroPrep Advance 滤板中 DNA 结合板所采用的高结合容量膜经过优化，可最大限度回收高质量的质粒 DNA。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AcroPrep Advance 滤膜板	Pall Corporation	PN 8175 (1 mL) 或 PN 8075 (350 µl)	3 μm 玻璃纤维，0.2 μm Supor® 膜用于澄清
AcroPrep Advance 滤膜板	Pall Corporation	PN 8132	用于 DNA 结合
真空 manifold	Pall Corporation	PN 5017
真空泵	Pall Corporation	PN 13157