我们报道了一种基于E. histolytica中转基因表达嵌合蛋白（FCU1）并利用前药5-氟胞嘧啶进行筛选的负筛选系统。FCU1蛋白是酵母胞嘧啶脱氨酶与尿嘧啶磷酸核糖基转移酶的融合蛋白。表达FCU1使E. histolytica对5-氟胞嘧啶的敏感性显著提高。
本文内容
摘要
摘要
Entamoeba histolytica 是阿米巴病的致病原，可感染全球最多达10%的人口。目前用于上调和下调基因表达的分子技术依赖于稳定维持质粒的转染。尽管这些技术增进了我们对溶组织内阿米巴毒力因子的理解，但若能将外源DNA整合到基因组中，则将有利于开展反向遗传学实验，从而为该寄生虫的研究带来显著优势。然而，该生物体面临若干挑战，包括无法筛选同源重组事件，以及难以从转染的滋养体中彻底清除附加体质粒DNA。后者导致外源DNA背景水平较高，严重干扰了真正发生基因组整合事件的滋养体的鉴定。本文报道了一种基于转基因表达酵母胞嘧啶脱氨酶与尿嘧啶磷酸核糖转移酶嵌合蛋白（FCU1）并利用前药5-氟胞嘧啶（5-FC）进行筛选的阴性筛选系统。FCU1酶可将无毒性的5-FC转化为有毒的5-氟尿嘧啶和5-氟尿苷-5'-单磷酸。E. histolytica 表达FCU1的细胞系对前药的敏感性较对照菌株高出30倍。
方案
1. 溶组织内阿米巴中的 FCU 负筛选系统
- 对照组（HM1/pKT3M）和实验组（HM1/pKT3M-FCU1）通过先前描述的技术构建1,2。将待研究的细胞系从冻存管接种至T-25培养瓶中，并在TYI-S-333培养基中加入适当的抗生素（12 μg/mL G418）以维持筛选压力。在37°C培养16–18小时后，培养瓶中的细胞应达到70–80%融合度。
- 用温热的TYI-S-33培养基配制新鲜的50 mM 5-氟胞嘧啶（5-FC，Sigma）储备液。充分涡旋振荡数分钟，确保5-FC完全溶解。通过0.22 μm滤器过滤除菌储备液。
- 将培养瓶置于冰上3–5分钟以收获滋养体，随后在室温下以200×g离心5分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于新鲜TYI培养基中并进行细胞计数。
- 典型的实验设计为：在48孔板中每孔接种0.5 × 104个细胞，终体积为1 mL；每种实验条件设三个重复。此外，为便于进行荧光检测，每个菌株在每个时间点需使用单独的培养板。
- 针对每种测试的5-FC浓度，每孔接种0.5 × 104个细胞，设三个重复。在TYI培养基中维持抗生素筛选压力。随后向各孔中加入所需量的5-FC储备液和滋养体。
- 将培养板置于厌氧袋中，在37°C孵育。
2. 选择效率的测定
- 用DMSO配制2 mg/mL的Cell tracker green CMFDA（Invitrogen）储备液。将储备液用无血清TYI培养基稀释1000倍，制备工作液。
- 彻底移除滋养体培养板中的培养基，加入150 μL含CMFDA的无血清TYI培养基。在37°C继续孵育1小时。
- 移除染料溶液，使用Spectramax M2微孔板荧光分光光度计读取吸光值。激发波长设为492 nm，荧光发射波长设为517 nm。
- 比较对照细胞与待测转染细胞的荧光值。
- 在每个时间点继续读取微孔板数据。每块板均需设置适当的阳性对照（仅含TYI）和阴性对照（含25 μg/mL潮霉素）孔。
3. 代表性结果
E. histolytica 转染子表现出对密码子优化的重组 FCU1 的高效表达（图1）。当正确执行本方案时，可在 0.5 mM 5-氟胞嘧啶存在条件下选择性清除表达 FCU1 的 E. histolytica 细胞。相比之下，对照细胞在高达 5 mM 的 5-FC 浓度下仍能正常生长，并在 72 至 96 小时之间达到汇合状态（图2-a）。在处理 48 小时后，显微镜下观察可见携带 FCU1 的细胞完全裂解。当使用活细胞染料 CMFDA 染色时，这些细胞的荧光信号也明显减弱，该染料常用于涉及大量样本的定量研究（图2-b）。FCU1/5-FC 系统是针对 E. histolytica 滋养体的一种高效且强大的负筛选工具。
图 1. 表达负向筛选标记的E. histolytica HM1 转染子的构建
（a）使用抗-c Myc 抗体在 Western blot 上检测到 FCU1 重组蛋白（上图）。与预期一致，在 FCU 转染子的总裂解液中可检测到一条 42 kDa 的条带（箭头所示），而在仅含载体的对照转染子中则无法检测到。下图显示同一张膜使用抗肌动蛋白（actin）抗体进行探针杂交，作为上样对照。（b）定量实时 PCR 结果显示 FCU1 特异性 mRNA 的表达水平，已标准化至 lgl4 内参。
图2. 体外 药物敏感性 E. histolytica 表达负筛选标记的转染子
生存曲线的（a) 对照转染细胞和 (b) 表达FCU1的转染细胞培养于48孔板中。细胞在含递增浓度前药5-氟胞嘧啶的培养基中生长；在X轴所示各时间点，通过CMFDA染色定量细胞存活率。Y轴表示荧光强度单位，直接反映存活细胞数量。请注意，与对照组相比，表达FCU1的转染细胞在0.5 mM前药浓度下表现出显著敏感性。在显微镜下观察，这些孔中在120小时时间点未见细胞，而相应对照孔中可见融合生长（数据未显示）。Hygro表示 25μg/ mL 潮霉素用作阴性对照。
讨论
尽管溶组织内阿米巴的分子生物学工具已取得显著进展，但目前尚无可用的方法来删除或破坏基因4。基因特异性表达的敲低已通过使用发夹RNA5、小干扰RNA6以及细菌表达的双链RNA7实现。然而，这些方法虽然对各自的目标基因有效，但仍存在若干局限性，包括需要使用昂贵的化学试剂、需持续进行抗生素筛选，以及由于随时间推移回复突变的发生率较高，需不断验证实验结果（Alicia Linford，个人交流）8。
任何质粒都可以在 溶组织内阿米巴 因为DNA复制起点显然没有严格的序列要求9，因此一旦转染，通常很难清除质粒。这限制了完整质粒在重组和基因敲除实验中的应用。负筛选标记是基因靶向方法中的关键组分，可用于消除重组亚群。我们已成功表达了密码子优化的FCU1基因 溶组织内阿米巴 并测试了其作为阴性筛选标记的潜力。该基因融合已被用于人类肿瘤细胞的自杀基因治疗，能够将前体药物5-FC代谢为有毒的下游产物，从而抑制RNA和DNA的合成10. FCU1 最近被用作负筛选标记 疟原虫另一种原生动物寄生虫。 疟原虫伯氏疟原虫 表达FCU1的细胞对前药的敏感性几乎提高了1000倍 体外 和 在体 在疟疾红细胞期小鼠模型中，5-FC处理杀灭了超过99.9%的感染性重组寄生虫11. E. histolytica 表达FCU1的细胞对前体药物5-FC的敏感性仅增加了30倍，与观察到的敏感性相比 P. berghei可能的原因是培养基中存在大量核苷酸，与有毒代谢物竞争。
在两者中 P. berghei 和 P. falciparum FCU1 标记已用于靶向基因破坏研究。11,12我们旨在利用同源重组技术对溶组织内阿米巴基因组进行操作。FCU1/5-FC负筛选系统的验证是实现这一目标的重要步骤。
披露
本视频的制作由 Sigma Aldrich, Inc. 赞助，该公司生产了本文所使用的一些试剂。
致谢
我们感谢Philippe Erbs博士为我们提供了FCU1基因的序列。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目AI 26649的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| TYI-S-33 培养基 | ATCC | 文中已包含参考文献 | |
| 5-氟胞嘧啶 | Sigma-Aldrich | F7129 | |
| 细胞追踪绿 CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Spectra Max M2 酶标仪 | Molecular Devices |
参考文献
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