巨大纤维系统是成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中一个简单的神经回路，包含果蝇体内最大的神经元。本文描述了通过直接刺激巨大纤维中间神经元后，记录背纵肌（DLM）和胸股肌（TTM）中的突触后电位，以监测该通路中突触传递的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
当受到惊吓时，成年 D. melanogaster 会通过跳跃至空中并飞离来作出反应。在包括 D. melanogaster 在内的许多无脊椎动物物种中，成虫阶段的“逃避”（或称“惊吓”）反应由一种称为巨纤维系统（Giant Fiber System, GFS）的多组分神经元回路介导。由于这些神经元具有相对较大的尺寸、独特的形态以及简单的连接方式，GFS 成为研究神经回路的一个理想模型系统。GFS 通路由两个双侧对称的巨纤维（Giant Fiber, GF）中间神经元组成，其轴突从脑部出发，沿中线经由颈连接（cervical connective）下行至胸神经节。在腹神经节的中胸神经节区（T2），GF 会形成电-化学突触，分别连接于：1）同侧的大型内侧树突运动神经元（TTMn），该神经元支配中胸股节/腿的主要伸肌——背股节肌（tergotrochanteral muscle, TTM）；以及 2）对侧的外周突触中间神经元（peripherally synapsing interneuron, PSI），后者继而与背纵肌（dorsal longitudinal muscles, DLMs）的运动神经元（DLMns）形成化学性（胆碱能）突触，而背纵肌是翅膀的降肌。至于背腹肌（dorsoventral muscles, DVMs，即翅膀的提肌）的神经通路至今尚未完全阐明（DLMs 与 DVMs 统称为间接飞行肌——它们并不直接附着于翅膀，而是通过扭曲邻近的胸部角质层间接带动翅膀运动）（King 和 Wyman, 1980；Allen et al., 2006）。DLMs 的双突触激活（经由 PSI）相较于 TTM 的单突触激活（~0.5 ms）造成轻微但关键的时间延迟，使 TTM 能够首先伸展股节，将果蝇推离地面。TTM 同时通过牵张激活 DLMs，而 DLMs 进而相互牵张激活 DVMs，从而维持飞行过程中的持续运动。GF 通路可通过施加感觉刺激（如“气流”或“熄灯”）间接激活，也可通过向脑部施加超阈值电刺激直接激活（本文所述方法）。在这两种情况下，动作电位均仅通过 GF、PSI 及 TTM/DLM 运动神经元传递至 TTM 和 DLM，尽管 TTMn 和 DLMn 确实还存在其他尚未明确的感觉输入。通过测量“反应潜伏期”（刺激与肌肉去极化之间的时间）以及“高频刺激跟随能力”（在一定数量的高频刺激下成功反应的次数），可对 GFS 各组分的功能状态进行可重复且定量的评估，包括中枢突触（GF-TTMn、GF-PSI、PSI-DLMn）以及化学性（谷氨酸能）神经肌肉接头（TTMn-TTM 和 DLMn-DLM）。该方法已被用于鉴定参与中枢突触形成的基因，并用于评估中枢神经系统（CNS）功能。
方案
1. 仪器与材料
- 这些实验采用标准的电生理学装置，包括刺激器、刺激隔离单元、两个微电极放大器、数据采集系统以及配备采集软件的计算机。附加设备包括法拉第笼、安装在悬臂架上的体视显微镜、隔振台、光源和记录平台。
- 使用五个显微操作器。其中两个显微操作器需要精细控制，用于定位记录电极；另外三个显微操作器仅需粗略控制，用于定位两个刺激电极和接地电极。DLM记录电极的显微操作器置于标本尾端（实验者左侧），TTM记录电极的显微操作器置于实验者与标本侧面之间（实验者稍偏左位置）。用于固定刺激电极的两个显微操作器置于标本头部位置（实验者右侧）。接地电极的显微操作器置于标本远端一侧。
- 拉制玻璃记录微电极，使其电阻为40–60 MΩ，并将其平放于由石蜡支撑的培养皿中保存。刺激使用两根经电解（NaOH） sharpened 钨电极。接地则采用一根钨丝或第三根电解法制备的电极。刺激电极和接地电极应在实验开始前制备并安装至显微操作器上，在整个实验过程中无需更换。
2. 准备黑腹果蝇（D. melanogaster）
- 设备设置完成后，即可开始准备果蝇。通过将果蝇置于冰上冷却或使用 CO2 对其进行麻醉。如果使用 CO2，则在开始实验前需留出足够时间（约 20 分钟），使气体效应完全消退。
- 使用镊子轻轻夹住果蝇腿部，将其转移至一个装有软蜡平台的培养皿中，软蜡平台倾斜角度约为 45°。接下来的四个步骤需在解剖显微镜下完成，操作位置应远离（但靠近）记录设备。
- 下一步是将果蝇固定在蜡上。将果蝇腹面朝下放置，头部朝上沿斜面定位。使用精细镊子将果蝇的腿成对向外伸展，并压入蜡中。
- 熟悉待记录肌肉的位置：背纵肌（DLM）和背板股节肌（TTM）。DLM 的皮下附着点对应于胸部中线与前背侧刚毛（或称刚毛）之间的区域。TTM 的附着点位于后侧和前侧翅上刚毛的背侧。确保翅膀不会阻碍对 DLM 或 TTM 肌纤维的接触，将翅膀向外展开并“粘”在蜡上固定。
- 使用精细镊子小心地将喙部向外拉出，并通过将其浸入蜡中加以固定。此步骤至关重要，需要一定练习，因为喙部柔软，容易从头部其他部分脱落。一旦发生脱落，应弃用该果蝇并重新开始。若未能妥善固定头部，在通过眼睛插入刺激电极时将引发问题。
3. 放置电极
- 将果蝇固定在石蜡上后，将培养皿连同果蝇一起转移到法拉第笼内的体视显微镜下。将果蝇侧向放置，使其头部位于实验者右侧。
- 下一步是插入电极。接地电极和刺激电极可在不通过显微镜观察的情况下插入。良好的记录依赖于精确的穿刺，因此建议先练习操作显微操纵器。借助显微操纵器将电极移近插入位置，以确保其正确放置并便于后续记录。
- 使用显微操纵器上的调节旋钮，将接地电极插入腹部后端。为将尖端 sharpened 钨丝刺激电极插入脑部，先用显微操纵器将其中一个电极的尖端移至果蝇一只眼睛表面轻轻接触，再对另一电极进行相同操作，使两个电极均刚好接触每只眼睛的外侧。然后依次将电极穿过每只眼睛，使电极尖端到达位于头壳后部的大脑（约 2–3 mm 深度）。
- 电极正确放置后可激活巨纤维系统。为检测刺激电极是否放置到位，可在刺激电极间施加一个短时（0.03 ms）、30–60 V 的电刺激，并观察翅膀运动以及飞行肌/腿部肌肉的抽动。
- 下一步是使用 Hamilton 注射器或热拉制的塑料注射器，用 3M KCl 反向填充玻璃微电极，并将电极装入精细控制的显微操纵器中。正确插入的微电极可用于多轮实验。
- 第一个记录电极将插入 DLM 肌纤维。存在两组左右对称的 DLM 肌肉，每组由六条独立的肌纤维组成。可在六条纤维中的任意一条进行记录；然而，由于 DLM 纤维 45a 和 45b 从胸部背侧较易接近，且两条纤维均由同一运动神经元支配，因此最常被选用。
- 使用离你较远一侧的显微操纵器，将记录电极插入 DLM 纤维 45a 或 45b。平台的倾斜设计使 DLM 电极能够以约 60–90° 的角度进入背侧体壁，有助于穿刺。在插入记录电极至胸部时，使用示波器模式的软件并同时观察计算机显示器。当电极进入肌肉时，基线将下降至接近零或负值。施加单次刺激进行测试，观察是否能记录到肌肉反应。
- 将另一根记录电极插入离你最近的 TTM 肌肉。由于肌肉附着点的位置，该电极需从前侧横向插入。操作时再次观察显示器，并在信号显示电极已进入肌肉后，用单次刺激进行测试。
4. 刺激与记录
- 现在可以开始刺激脑部，并记录腿部和飞行肌肉的反应。在刺激电极上施加一个短暂（0.03 ms）的刺激，电压从 30 V 开始逐渐增加至 60 V，直至观察到反应（即肌肉抽搐，以及在计算机显示器上观察到的肌细胞去极化）。在后续实验中，将刺激电压设定为高于反应阈值 5–10 V。
- 为测量反应潜伏期，每次给予单次刺激，共至少 5 次，每次刺激之间间隔 5 秒休息时间。
- 通过以不同频率施加刺激串来确定“跟随频率”。通常在 100 Hz（每次刺激间隔 10 ms）、200 Hz（每次刺激间隔 5 ms）和 300 Hz（每次刺激间隔 3 ms）下，各给予 10 组、每组 10 次刺激的刺激串。每组刺激串之间留出 2 秒的休息时间。
5. 结果：巨大纤维通路中的反应潜伏期与跟随频率
- 反应潜伏期是指脑部受到刺激至肌肉去极化之间的时间。该图比较了单次刺激下DLM和TTM的反应潜伏期。GF-TTM通路的潜伏期在0.7至1.2毫秒之间，GF-DLM通路在1.3至1.7毫秒之间，表明制备状态良好且记录技术正确。潜伏期可能因基因型、遗传背景、温度和年龄而有所变化。
图1（A和B）。 代表性记录轨迹，显示单次脑部刺激后TTM和DLM的反应。 - 如图所示，与较大的DLM肌纤维相比，TTM的记录在突触后电位（PSP）的幅度和波形方面表现出更大的变异性；这种变异性增加的原因在于TTM肌纤维尺寸较小。然而，这种变异性并不影响巨纤维至TTM通路的反应潜伏期数值。
图1（C和D）。 来自4只个体果蝇的TTM和DLM的进一步“反应潜伏期”轨迹。注意TTM轨迹在PSP波形上表现出变异性，但反应潜伏期不受影响。而DLM的PSP波形变异性较小。
- 通过计算在100 Hz、200 Hz和300 Hz刺激频率下DLM和TTM通路每10次刺激中成功反应的比例，比较其“跟随频率”表现。在100 Hz时，TTM和DLM均能以1:1的比例跟随刺激。当刺激频率超过100 Hz时，DLM反应开始出现失败，这是因为两个中间神经元之间的化学突触在刺激间隔内没有足够时间恢复。然而，TTM反应即使在超过300 Hz时仍能保持与刺激1:1的同步。
图2。 代表性轨迹，显示“跟随频率”的记录结果。在100 Hz时，TTM和DLM均对全部10次刺激产生反应（左侧）。在200 Hz时，DLM反应开始出现失败（星号标记）。
6. 代表性结果
野生型短潜伏期反应（刺激电极置于眼部，绕过感觉感受器并直接激活GF神经回路）依赖于基因型、遗传背景、温度和年龄，在GF-TTM通路中潜伏期范围为0.7至1.2 ms，在GF-DLM通路中为1.3至1.7 ms（Tanouye和Wyman，1980；Thomas和Wyman，1984；Engel和Wu，1992；Allen和Murphey，2007；Phelan 等，2008年；Augustin 等，未发表）。这种极短的TTM潜伏期是由于单突触通路中GF-TTMn电化学突触的强健性所致，而DLM潜伏期较长则是由于该通路为双突触结构，并包含一个化学突触（PSI-DLMn）。中等及长潜伏期反应（>3 ms）是由GF传入神经的激活引起的，可通过使用较低强度的刺激或提供视觉“熄灯”信号来实现。在100 Hz时，TTM和DLM均应与刺激以1:1的比例跟随。当频率超过100 Hz时，由于PSI与DLMns之间的化学突触在刺激间隔小于10 ms时无法充分恢复，DLM反应将开始出现失同步；然而，TTM反应即使在超过300 Hz时仍能保持与刺激1:1的跟随（Tanouye and Wyman, 1980；Engel and Wu, 1992；Allen 等，2007；Martinez 等，2007年）。该基因的突变 shakB 基因，编码一个 果蝇 缝隙连接通道（“innexin”）显著延长了GF-TTM通路的反应潜伏期（约1.5 ms），而GF-DLM分支则无反应（Allen和Murphey，2007；Phelan 等，2008）。通过直接刺激胸神经节可恢复突变体的反应，表明延迟效应并非源于神经肌肉传递的中断。与野生型果蝇相比，这些突变体跟随高频刺激的能力也受到损害；在野生型果蝇中，GF-DLM 和 GF-TTM 通路通常能够以 1:1 的比例分别跟随高达 100 Hz 和 300 Hz 的 10 次刺激。需要指出的是，这些频率远高于飞行持续过程中收缩肌肉所接受的正常刺激频率（3–10 Hz）（Hummon 和 Costello，1989）。
用于描述GFS输出稳定性的另一个参数是“不应期”，即在产生两次肌肉反应的前提下，两个刺激脉冲之间的最短时间间隔。TTM的不应期在1-4毫秒之间，而DLM的不应期为7-15毫秒。DLM具有相对较长的不应期，这是由于PSI-DLMn连接处存在相对不稳定的化学突触所致（Tanouye 和 Wyman, 1980; Gorczyca 和 Hall, 1984; Engel 和 Wu, 1992; Banerjee et al., 2004; Allen 和 Godenschwege, 2010）。
讨论
在尝试获得高质量记录时，最重要的注意事项之一是制备样本的正确方位和健康状态。理想情况下，果蝇在记录结束时仍应存活，并对电刺激有反应。为了使记录电极最有效地穿透胸部外骨骼，应将果蝇粘附在表面上，使其与电极成直角；如有必要，可用钨制解剖刀去除部分背侧胸部表皮，暴露DLM飞行肌，从而便于电极插入（此步骤还有一个额外优势，即降低玻璃电极尖端断裂的可能性）。同时必须注意避免将电极推过位于皮下层的DLM肌和TTM肌。果蝇头部应牢固固定，以确保刺激电极能正确插入脑部，并防止其在记录过程中被拉出。
由于其体积较大且形态特征明确，巨纤维系统（GFS）是果蝇（Drosophila）中最易于研究的神经通路之一。电突触对小分子量示踪染料具有通透性，因此可以可视化电耦合的神经元；此外，目前已有多类可用的GAL4品系，可在特定细胞或细胞群中调控基因表达水平（Jacobs et al., 2000; Allen et al., 2006）。除了上述优势外，该神经回路的传入和胸部组分还表现出习惯化、自发恢复以及去习惯化等特性，使得果蝇（Drosophila）GFS成为研究神经可塑性的理想模型系统（Engel and Wu, 1996）。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作获得了惠康信托基金对 L.P. 的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| S48 方波脉冲刺激器 | 草本科技 | ||
| 刺激单元 | 草本科技 | ||
| SIU5 RF 变压器隔离单元 | 草本科技 | ||
| 5A 双通道细胞内微电极–电极放大器 | 吉廷仪器有限公司 | ||
| Digidata 1440A 数据采集系统 | Molecular Devices | ||
| 模拟-数字转换 Digidata 1320 和 Axoscope 9.0 软件 | Molecular Devices | ||
| 配备手动显微操作器的记录平台 | Narishige International | ||
| 光源 | Fostec | ||
| Wild M5 体视显微镜 | Wild Heerbrugg | ||
| 减振台 | TMC | ||
| 用于微加工的硼硅酸盐玻璃管–电极 | Sutter Instrument Co. | ||
| P-95 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument Co. | ||
| Microfil 34 号，67 毫米（电极填充器） | World Precision Instruments, Inc. | MF34G-5 | |
| 显微解剖工具（镊子、…) | Fine Science Tools | ||
| 解剖（体视）显微镜 | 徕卡显微系统 | ||
| 法拉第笼 | 未知 | ||
| 其他：塑料注射器、钨接地线、NaOH sharpened tungsten electrodes、KCl、蜡制平台、带显示器的PC…… |
参考文献
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