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小鼠卒中模型——线栓法大脑中动脉阻塞

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DOI：

10.3791/2423

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2011年1月6日

 ,  ,  , 
1Department for Experimental Neurology, Center for Stroke Research Berlin, Charité Universitätsmedizin

本文内容

摘要

大脑中动脉线栓法阻塞是研究小鼠缺血性脑卒中的常用模型。

摘要

脑卒中是导致死亡和成人残疾的最常见病因之一，尤其在高度发达国家中更为突出。然而，迄今为止的治疗选择非常有限。为了满足对新型治疗策略的需求，实验性脑卒中研究常采用啮齿类动物局灶性脑缺血模型。大多数研究人员使用小鼠或大鼠的永久性或短暂性大脑中动脉（MCA）阻塞模型。

通过血管内缝线技术（即所谓的丝线或缝线模型）对大脑中动脉（MCA）进行近端阻塞，可能是实验性脑卒中研究中最常用的模型。这种血管内MCAO模型具有相对微创的优点，可诱导MCA供血区域可重复的短暂性或永久性缺血。血管内方法可中断该动脉整个供血区域的血流。丝线阻塞位于供应基底节的豆纹动脉近端，从而阻断血流。MCA的丝线阻塞可导致大脑皮层和纹状体区域出现可重复的病灶，且可设置为永久性或短暂性阻塞。相比之下，远端MCA阻塞模型（即阻塞部位位于豆纹动脉分支之后）通常保留纹状体，主要累及新皮层，但这些模型通常需要开颅。本文所展示的模型中，将一根硅胶包被的丝线经颈总动脉插入，沿颈内动脉推进至Willis环，从而阻断大脑中动脉的起始部。在临床患者中，大脑中动脉的阻塞是缺血性脑卒中最常见的病因之一。由于该模型可根据再灌注时间自由选择不同的缺血持续时间，因此可产生不同程度严重性的缺血性病灶。通过拔出阻塞丝线实现再灌注，可在一定程度上模拟人类血栓栓塞性病灶发生自发性或治疗性（tPA）溶解后血流的恢复过程。

在本视频中，我们将介绍该模型的基本技术，以及可能限制其预测价值的主要陷阱和混杂因素。

方案

为确保高质量和可重复性，我们建议使用标准操作程序（Standard Operating Procedures, SOP）。本视频中采用的是我们实验室制定并使用的已发表标准操作程序。1

1. 大脑中动脉阻塞

  1. 小鼠使用适当的麻醉剂进行麻醉 方案 在兽医人员指导下进行。（例如，使用麻醉蒸发器以1.5–2%异氟烷诱导麻醉，随后以1.0–1.5%异氟烷维持麻醉，混合气体为2/3 N₂O和1/3 O₂）。
    1. 小鼠的体温维持在 36.5°C ± 0.5°C 手术过程中使用加热板。强烈推荐使用反馈控制的加热垫，可根据小鼠的直肠温度调节加热。
    2. 用适当的消毒剂（例如70%乙醇）对皮肤及周围毛发进行消毒，随后将其擦干。
  2. 沿颈部正中线做切口，并分离软组织。
  3. 左侧颈总动脉（LCCA）从周围神经中仔细游离（避免损伤迷走神经），并使用6.0/7.0号线进行结扎，也可使用5.0号线。
  4. 然后分离左侧颈外动脉（LECA）并打第二个结。
  5. 接下来，分离左侧颈内动脉（LICA），并用6.0尼龙丝线制备结。
  6. 在获得左侧颈内动脉（LICA）和左侧翼腭动脉（LPA）的良好视野后，使用微型血管夹对这两条动脉进行夹闭。
  7. 在左颈总动脉（LCCA）分叉为左外颈动脉（LECA）和左内颈动脉（LICA）之前，于LCCA上剪开一小孔。将一根由8.0号尼龙单丝涂覆硅胶硬化剂混合物（见下文）制成的单丝线插入LICA，直至其被动脉夹阻挡而停止。操作时需注意避免进入枕动脉。（图1）
  8. 夹闭的动脉被打开，同时将细丝插入左侧颈内动脉（LICA），以阻塞大脑中动脉（LMCA）在威尔氏环（circle of Willis）的起始处。
  9. LICA 上的第三个结扎紧以固定缝合线的位置。
  10. 小鼠皮下注射0.5 mL生理盐水以补充液体。为缓解疼痛，伤口局部涂抹利多卡因凝胶。
  11. 若计划进行再灌注，小鼠在加热的笼子中保持30 - 90分钟的闭塞状态，伤口可用小型缝合夹闭合。之后，实施第二次麻醉，暂时打开颈总动脉（ICA）上的第三个结，撤出线栓。
  12. 剩余的缝线被缩短，并用外科缝合线缝合皮肤。
  13. 所有动物均接受第二次体积补充，具体方法如上所述。
  14. 动物被置于加热的笼子中两小时，以控制体温。
    1. 动物在术后必须每天检查是否有不适迹象。小鼠可能出现术后体重减轻。为促进进食，会在培养皿中提供捣碎的食物，并将培养皿置于笼底。食物需每日更换，持续七天。

2. 假手术操作

  1. 对于假手术操作，将尼龙线插入以阻塞左中动脉（LMCA），然后立即撤出，以实现即时再灌注（1.8）。后续操作与接受脑缺血处理的动物所进行的操作完全相同（1.9 - 1.14），包括第二次麻醉。

3. 细丝的制备

  1. 应考虑尼龙丝的无菌性。使用无菌器械以及术后对尼龙丝进行恰当处理，是实现无菌手术的前提。由于许多常见的灭菌方法可能会降低尼龙丝的质量，因此对其消毒较为困难。但可采用辐射法（例如紫外光或γ射线）或化学灭菌法（例如使用环氧乙烷等高反应性气体）进行处理。
  2. 在显微镜下将8.0尼龙丝截成11 mm长的小段
  3. 尼龙丝尖端必须均匀且完全地涂覆一层硬化剂混合物（Xantopren M Mucosa与Activator NF Optosil），涂覆长度为8 mm

4. 代表性结果

根据血流阻断时间的长短，会出现不同的运动和行为功能障碍。在脑缺血30分钟和60分钟之后，大多数动物均表现出对侧向推力的抵抗能力下降以及因运动功能障碍导致的转圈行为。较轻的损伤表现为前肢屈曲姿势。这些易于观察的体征可作为评估手术成功与否的基本评分依据。2

从形态学角度，可通过组织学或磁共振成像（MRI）对病灶进行评估。大脑中动脉阻塞60分钟会导致包括纹状体和新皮层区域在内的组织梗死性坏死，而30分钟的缺血则主要引起局限于纹状体的神经元细胞死亡3（图2）。在梗死体积方面，我们期望在一组手术操作中其标准差低于30%。死亡率与阻塞时间相关，30分钟缺血后的死亡率约为5%，60分钟缺血后则为10–20%。

另一种微创方法是在手术过程中使用激光多普勒血流仪（LDF），以直接监测手术效果。在单个动物个体中，血流值降低至阻塞前水平的10–20%可明确提示局灶性脑缺血成功建立。 4 然而，激光多普勒血流仪（LDF）不能用于个体间的比较，因为LDF只能测量小范围且有限组织样本体积内血流量的定量变化（以百分比表示），无法提供有关血流减少空间范围的信息。 5

有多种测试可用于评估卒中后的行为学特征，包括步态分析6,7、转棒实验8、垂直杆实验9,10、黏附去除实验11,12、阶梯实验13,14、梯格行走实验15,16以及莫里斯水迷宫实验17。在所有这些测试中，接受大脑中动脉阻塞（MCAo）处理的小鼠表现均不如对照组动物。

大脑动脉环示意图；标注的脑动脉：MCA、ICA、PPA、ECA、CCA；血管解剖结构。
图1. 小鼠脑部供血血管结构示意图（背景中显示）。不同品系可能存在变异，例如枕动脉有时起源于颈内动脉。

MCAo 实验示意图，脑血流量图，30、60 分钟时的再灌注，脑缺血。
图 2. 近端大脑中动脉阻塞（MCAo）模型在不同再灌注时间点后的典型病灶范围示意图。图中展示了 MCAo 后神经功能活动与脑血流量的典型变化过程。（MCAo：大脑中动脉阻塞，LDF：激光多普勒血流测量）

讨论

本文介绍的短暂性近端大脑中动脉闭塞模型18,19模拟了患者中最常见的缺血性脑卒中类型之一20。根据再灌注时间的不同，该模型可产生从短暂性脑缺血发作（TIA）到累及缺血半球大部分区域的大面积梗死等多种程度的脑损伤，从而允许研究人员研究脑卒中后不同的病理生理机制20,21。

手术可在较短时间内完成，并产生高度可重复的病灶。然而，这需要对混杂因素进行严格控制。22 手术技术上的微小差异可能导致对梗死产生不同的影响。23,24 此外，由于脑血管解剖结构存在差异，不同小鼠品系表现出不同的结果。25,26 体温会影响神经损伤程度，低温会导致病灶缩小27，而高热则导致更严重的神经功能缺损28。因此，在该模型中，体温的控制与维持至关重要。29 此外，血压和血气是影响结果的重要混杂因素，需加以监测。30,31 建议采用快速且微创的方法（如无创血压测量、合适且易于获取的采血部位）。麻醉剂的选择也极为重要，因为某些麻醉剂可能具有神经保护作用和/或血管扩张作用，例如异氟烷（Isoflurane）。32 因此，麻醉暴露时间应尽可能短，并保持标准化。我们排除手术时间超过15分钟的动物。

剃除手术部位的毛发会产生微小擦伤和炎症，并释放毛发碎片。这可能进一步加剧炎症并促进局部感染，从而影响卒中的病理生理过程。饲养条件，尤其是环境丰富化的使用，可能影响卒中结局，应在研究报告中进行标准化描述。6,33,34 环境丰富化的使用及其对可重复性的影响目前仍存在争议。35 另一个重要的混杂因素是卒中后感染风险，尤其是在较长时间缺血后36，这会导致额外的疾病负担和死亡率升高。37,38 由于感染通常在术后第3至5天左右出现症状，这对此类模型的长期随访具有重要意义。

为了获得与中风新型治疗策略开发相关的研究结果，临床前转化中风研究中的标准化和质量控制至关重要。39 “良好实验室规范”40,41对此作出要求：

  1. 所用动物的适当且详细的描述；
  2. 样本量计算及预期效应量的报告；
  3. 研究开始前设定的纳入和排除标准；
  4. 分组时的随机化分配；
  5. 对研究者实施的分配隐藏；
  6. 报告被排除在分析之外的动物；
  7. 对结果进行盲法评估；
  8. 报告潜在的利益冲突及研究资助情况。

披露

动物实验遵循德国柏林州卫生与社会事务局（Landesamt fuer Gesundheit und Soziales）制定的指南和规定进行。

致谢

本工作由欧洲共同体第七个框架计划（FP7/2007-2013）资助，资助协议编号为 n° 201024 和 n° 202213（欧洲卒中网络）。额外资助由德国联邦教育与研究部（柏林卒中研究中心）以及德国研究基金会（卓越集群 NEUROCURE）提供。

作者感谢柏林夏里特医院实验神经病学系的Mareike Thielke在手术期间提供的支持，以及夏里特视频服务中心的Elke Ludwig在动画制作方面的协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
手术剪（用于皮肤切口）Fine Science Tools14028-10
2 把杜蒙特镊子（医用 #5 直头）Fine Science Tools11253-20
弹簧剪（Vannas 型）Fine Science Tools15000-00
用于固定微夹的施夹镊Fine Science Tools00072-14
微血管夹（例如 S&G B1-V）Fine Science Tools00396-01也可使用 Serrefine
2 把 Hartmann 止血钳Fine Science Tools13002-10
持针器（Olsen-Hegar 型或其他）Fine Science Tools12002-14
标准解剖镊（用于伤口闭合）Fine Science Tools11000-12
5/0 缝线Suprama用于血管结扎
6/0 缝线Suprama用于皮肤缝合，也可使用 5/0
利多卡因（例如 2% 丁卡因凝胶）AstraZeneca或其他局部镇痛剂
解剖显微镜（体视显微镜），放大倍数 6x 至最大 40xLeica ZeissMZ6 Stemi2000C
冷光源Leica MicrosystemsKL1500
带温度反馈控制的加热垫系统Fine Science Tools21052-00含小鼠垫和小型探头
异氟烷麻醉系统
异氟烷Abott
兽用复苏舱Peco ServicesV1200加热笼
8.0 尼龙缝线SupramaTEL181005用于包埋
手术刀用于将缝线切割成段
直尺用于裁剪合适长度的缝线
Xantopren M MucosaHeraeus Instruments
Activator Universal PlusHeraeus InstrumentsOptosil - Xantopren
2 把杜蒙特镊子（医用 #5 直头）Fine Science Tools11253-20
用于存放和夹取未包埋缝线的柔软衬垫例如棉签、泡沫、…
用于存放新制备缝线的容器例如培养皿、软质泡沫、…

参考文献

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