通过流式细胞术对GLUT4向质膜转位进行定量测量

摘要

本方案描述了一种通过流式细胞术快速定量GLUT4从细胞质向细胞膜转位的技术。

摘要

葡萄糖是身体的主要能量来源，需要持续调节其血液浓度。胰腺释放的胰岛素可促进胰岛素敏感组织（尤其是大脑、骨骼肌和脂肪细胞）对葡萄糖的摄取。患有2型糖尿病和/或肥胖症的患者常出现胰岛素抵抗，无法有效控制其葡萄糖稳态。深入理解胰岛素抵抗的机制可能为2型糖尿病提供新的治疗策略。

葡萄糖转运蛋白GLUT家族包含十三个成员，分布于全身不同组织中¹。葡萄糖转运蛋白4型（GLUT4）是介导胰岛素敏感组织（如骨骼肌）摄取葡萄糖的主要转运蛋白。当胰岛素与其受体结合后，含有GLUT4的囊泡从细胞质转位至质膜，从而促进葡萄糖的摄取。GLUT4转位减少是2型糖尿病胰岛素抵抗的原因之一^2,3。

通过免疫细胞化学方法，使用与荧光染料偶联的GLUT4特异性抗体，可以观察到GLUT4从细胞质向质膜的转位。

本文介绍了一种利用流式细胞术定量检测在选定时间内细胞中GLUT4向质膜转位总量的技术。该方案快速高效（包括胰岛素孵育在内少于4小时），单次实验每种条件下可分析少至3,000个、多至100万个细胞。该方法依赖于靶向GLUT4转运蛋白胞外表位的特异性抗体，当GLUT4在转位至质膜后暴露于细胞外环境时，抗体即可立即与其结合。

方案

1. 细胞染色

1. 准备细胞。应使用处于活跃生长期的细胞（60–80% 汇合度）。将细胞进行无血清培养过夜，以每孔0.1百万的密度接种于24孔板中，每孔加入0.5 mL无血清培养基，置于培养箱（37°C，5% CO₂）中孵育30分钟至2小时，使细胞从胰酶消化中恢复。
2. 混合一抗和二抗。按每孔用量配制混合液（5 μL GLUT4一抗 + 1 μL AlexaFluor 488标记的鸡抗山羊IgG二抗），乘以所需孔数。室温避光孵育10分钟。
3. 用培养基稀释胰岛素，配制2倍工作浓度的胰岛素溶液。
4. 检查细胞是否已贴壁。
5. 向含细胞的孔中轻柔加入6 μL抗体混合液和0.5 mL 2倍工作浓度的胰岛素溶液。避免培养基产生湍流。置于培养箱（37°C，5% CO₂）中避光孵育30分钟。
6. 向每孔加入0.5 mL PBS + 1% 多聚甲醛（PFA），固定细胞，过程中不要晃动细胞。室温避光孵育20分钟。
7. 若细胞已贴壁，使用细胞刮轻轻刮下细胞。将细胞（总体积1 mL）转移至适合流式细胞仪使用的离心管中，离心以收集细胞沉淀。
8. 用1 mL PBS洗涤沉淀两次，最后将细胞重悬于0.4 mL PBS + 1% PFA中。此时，样品可用铝箔包裹后置于冰箱（4–8°C）保存，或直接用于流式细胞仪检测以获取数据。

2. 数据采集

1. 在侧向散射光（SSC）与前向散射光（FCS）图中，对活细胞设定一个较宽的门。使用阴性对照管（未用胰岛素处理的细胞或使用同型对照抗体“染色”的细胞）来设定FL1参数。确保峰完全位于图内，不要在低端被截断。
2. 每管至少采集10,000个细胞的数据。

3. 数据分析

1. 在SSC与FSC图中圈选活细胞门控区域（图1A）。绘制门控内活细胞的AlexaFluor 488荧光强度与细胞数量的直方图（图1B）。可叠加不同直方图以直观比较差异，但进行定量分析时，应确定各细胞群体的平均荧光强度和中位荧光强度，并使用这些数值进行比较（图1C）。
2. 将数据归一化至无胰岛素处理组所得值，如图1C和图1D所示。

4. 代表性结果

在从健康个体（无胰岛素抵抗）分离的成肌细胞中，胰岛素可诱导GLUT4以剂量依赖的方式从细胞质转位至质膜（图1，左）。相比之下，胰岛素不能诱导从胰岛素抵抗患者分离的成肌细胞中GLUT4向质膜的转位（图1，右）。

图1. 染色实验示例。成肌细胞分别来自无胰岛素抵抗的供体（左）和患有胰岛素抵抗的患者（右）。A，SSC（侧向散射）与FCS（前向散射）图，其中对活细胞设门。B，A图中设门的细胞，用针对GLUT4外在表位的抗体进行染色，未受刺激（红色）或经1 nM（蓝色）、10 nM（橙色）或100 nM（绿色）胰岛素刺激。为清晰显示图像，对于具有胰岛素抵抗的细胞，我们仅展示无胰岛素和100 nM胰岛素刺激条件下的数据。C，B图中直方图所示的平均荧光强度（MFI）被归一化至未受刺激（无胰岛素）细胞的MFI值。D，B图中直方图数据归一化后的MFI曲线图。

讨论

我们已展示了一种通过流式细胞术快速定量GLUT4从细胞质向细胞膜转位的技术。

GLUT4 仅在细胞质膜上瞬时表达，并会被内吞。由于结合的抗体即使在内吞过程中仍与 GLUT4 保持结合，因此荧光信号反映了在胰岛素存在下选定孵育时间内暴露于质膜的 GLUT4 总量。

只要存在针对目标蛋白的胞外表位的优质抗体，该技术也可用于研究其他蛋白从细胞内区室向质膜的转位。例如，目前常用一种类似的检测方法，通过检测CD107a向细胞质膜的转位来评估细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤淋巴细胞的脱颗粒速率^4,5。在细胞凋亡或坏死过程中，磷脂酰丝氨酸从质膜内侧向外侧的转位也可通过流式细胞术检测，使用荧光标记的Annexin V即可实现⁶。

除了检测速度快之外，流式细胞术还具有能够研究混合细胞群体中蛋白质向质膜转位的优势。实际上，可以同时对细胞亚群标志物和目标蛋白进行染色，随后在多激光流式细胞仪上获取数据⁷。

方案第1.2段中提供的抗体用量仅为起始参考值；我们建议您使用目标细胞对抗体进行滴定，以确定能够产生最大信号的最低抗体浓度。本实验所用的抗人GLUT4一抗的合适起始用量范围为每管1-10 μL（即每管0.2-2 μg抗体），每管所含细胞数不超过100万个。对于其他一抗，请参考供应商提供的说明书。

由于不同供体之间以及不同实验之间的细胞自发荧光存在差异，因此有必要对数据进行标准化处理。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗人 GLUT4 抗体	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-1606	针对 GLUT4 的外部表位
与 AlexaFluor 488 偶联的鸡抗山羊 IgG	Invitrogen	A-21467
重组人胰岛素	Sigma-Aldrich	I2643
细胞刮刀	VWR international	29942-118	裁剪以适配孔板
用于 FACS 的 5 ml 管	VWR international	60819-138	适配所有 BD 仪器